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技术文章
细胞ATP/ADP/AMP含量效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒 产品说明书（中文版）
点击次数：2849 发布时间：2020/9/10 9:03:10
腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5＇-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5＇-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3＇,5＇-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。
产品内容
HPBIO清理液（Reagent A） 60毫升
HPBIO裂解液（Reagent B） 10毫升
HPBIO酸性液（Reagent C） 1毫升
HPBIO中和液（Reagent D） 2毫升
HPBIO流相液A（Reagent E） 500毫升
HPBIO流相液B（Reagent F） 500毫升
HPBIO 标准液（Reagent G）500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HPBIO标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HPBIO酸性液（Reagent C）和HPBIO中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效 证6月
用户自备
HANK平衡盐缓冲溶液（HPBIO12028）或PBS缓冲溶液（HPBIO12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于细胞脱离
全细胞培养液（HPBIO12052）：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
4℃（微型）台式离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定
实验步骤
一、样品准备
1．准备1瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（1 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2．加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
4．置入37℃培养箱3分种
5．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
6．分别加入10毫升用户自备的 全细胞培养液
7．移入一个50毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从此步骤开始）
8．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
9．小心抽去上清液
10．加入3毫升预冷的HPBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
11．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
12．小心抽去上清液
13．加入500微升预冷的HPBIO裂解液（Reagent B）
14．涡旋震荡5，充分混匀细胞颗粒群
15．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
16．在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）
17．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
18．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
19．小心移取360微升上清液到1.5毫升离心管
1．加入40微升预冷的HPBIO酸性液（Reagent C）
2．涡旋震荡1分钟
3．转移到1.5毫升离心管
4．放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g
5．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
6．加入62微升HPBIO中和液（Reagent D），充分混匀
7．置于冰槽里静置30分钟
8．即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）
20．放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测
二、测定准备
1．开启仪器预热15分钟
2．根据下表设置效液相色谱仪（HPLC）参数
参数推荐补充说明
色谱柱长度：25cm
直径：4.6mmWaters仪器或
Agilent仪器
固定相ODS
流动相HPBIO流相液A（Reagent E）和HPBIO流相液B（Reagent F）参见运行程序
流速1.3毫升/分钟
注射容量50微升10微升至100微升
检测紫外
波长254nm
柱温25℃
出峰时间（retention）5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)参考
运行时间15分钟参考
3．运行程序
运行时段程序时间
开机后预运行100% HPBIO流相液A（Reagent E）总10分钟
检测运行时段100% HPBIO流相液A（Reagent E）
0%HPBIO流相液B（Reagent F）0至9分钟
100% HPBIO流相液A（Reagent E）至
75% HPBIO流相液A（Reagent E）
0%HPBIO流相液B（Reagent F）至25%HPBIO流相液B（Reagent F）9至15分钟
关机运行100% HPBIO流相液A（Reagent E）
0%HPBIO流相液B（Reagent F）总10分钟
三、标准样品配制
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2．分别加入100微升HPBIO流相液A（Reagent E）到1至5号管
3．移取100微升HPBIO标准液（Reagent G）到1号管，混匀
4．小心移取100微升1号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到2号管，混匀
5．小心移取100微升2号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到3号管，混匀
6．小心移取100微升3号管稀释的HPBIO标准液（Reagent G）到4号管，混匀
7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号HPBIO流相液A（Reagent E）HPBIO标准液（Reagent G）标准ATP/ADP/AMP浓度
1 100微升100微升100微摩尔/升
2100微升100微升1号管50微摩尔/升
3100微升100微升2号管25微摩尔/升
4100微升100微升3号管12.5微摩尔/升
5100微升00
四、色谱分析
1．将上述配制的HPBIO标准液（Reagent G）和待测样品放进冰槽里等待
2．每次（每个样品）注射50微升
3．按照检测运行程序每次（每个样品）运行15分钟
4．获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录
五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度
1．方法一：通过仪器中的软件进行测算
2．方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）
3．方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）
样本ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积
注意事项
1．本产品为25次操作，包括标准液
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，标准液测定只需1次
4．试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜
5．HPBIO酸性液（Reagent C）和HPBIO中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全
6．建议使用HPBIO流相液A（Reagent E）作为阴性对照或作为基准线
7．色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等
8．用户可以使用已知浓度的HPBIO标准液（Reagent G）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）
9．腺嘌呤核苷酸的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的HPBIO标准液（Reagent G）实际出峰为准
10．用户可以根据要求，计算实际浓度为：纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等
11．如果待测样品浓度过或过低，可以调整样品浓度
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
