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通用型组织/细胞β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒产品说明书
点击次数： 73发布时间：2022/8/4 14:40:53
- 上 传 者： 上海极威生物科技有限公司
- 上传时间： 2022/8/4 14:40:53
- 文件大小： 60KB
- 文件类型： doc
- 所属分类： 应用方法
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资料简介： 主要用途 细胞β-半乳糖苷酶原位染色试剂是一种旨在以X-Gal为底物，通过组织/细胞内表达的外源性细菌β-半乳糖苷酶的催化所生成的深蓝色的沉积产物，从而在光学显微镜下观察到蓝色表达的细胞，藉此建立一种简单的目测颜色来识别报告基因阳性细胞的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的人体和动物细胞、活体组织以及冰冻组织切片检测。产品即到即用，性能稳定，参数优化，着色敏感。 技术背景 大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（ß-galactosidase；ß-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。X-Gal （5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ß-D-Galacto pyranoside）是生物化学中常用的一种有机物，β-半乳糖苷酶可以将X-Gal转化为蓝色的产物，由此用它作为生色底物，来建立一种简单的目测颜色来确定细胞β-半乳糖苷酶的活性，从而通过光学显微镜鉴别转染组织/细胞报告基因的存在与否和强弱表现。 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 固定液（Reagent B） 毫升 净化液（Reagent C） 毫升 稀释液（Reagent D） 毫升 染色液（Reagent E） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存染色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；稀释液（Reagent D）和染色液（Reagent E）用铝箔封裹，避免光照；有效保证6月 用户自备 2毫升离心管：用于配制染色工作液 15毫升锥形离心管：用于配制染色工作液 恒温培养箱：用于染色孵育 切片仪：用于石蜡或冰冻切片 光学显微镜：用于观察染色后的细胞 实验步骤 一、 细胞染色 操作一、25cm2细胞培养瓶染色 实验开始前，将试剂盒里的染色液（Reagent E）从－20℃的冰箱里取出，放进冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀释液（Reagent D）到2毫升离心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混匀后，放进37℃恒温水槽里预热，标记为染色工作液。然后进行下列操作： 1． 小心抽去25cm2细胞培养瓶里的培养液 2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面 3． 小心抽去清理液 4． 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），覆盖整个生长表面 5． 在室温下孵育5分钟 6． 小心抽去固定液 7． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗细胞表面 8． 小心抽去清理液 9． 重复实验步骤7和8一次 10． 小心加入xx毫升预热的染色工作液，覆盖整个细胞表面 11． 放进37℃培养箱，孵育3小时至16小时，或直至细胞呈现蓝色（注意：避免液体蒸发） 12． 在光学显微镜下观察和计数：表达β- 半乳糖苷酶的细胞为阳性细胞，呈现蓝色 13． （选择步骤）核固红复染：细胞核呈现粉红色（建议使用核固红复染试剂盒――G&VS40011） 操作二、24孔细胞培养板染色 实验开始前，将试剂盒里的染色液（Reagent E）从－20℃的冰箱里取出，放进冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀释液（Reagent D）到15毫升锥形离心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混匀后，放进37℃恒温水槽里预热，标记为染色工作液。然后进行下列操作： 1．小心抽去24孔细胞培养板里的培养液 2．每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面 3．小心抽去每孔里的清理液 4．每孔加入xx微升固定液（Reagent B），覆盖整个生长表面 5．在室温下孵育5分钟 6．小心抽去固定液 7．每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗细胞表面 8．小心抽去酸性液 9．重复实验步骤7和8一次 10．每孔加入xx微升预热的染色工作液，覆盖整个细胞表面 11．放进37℃培养箱，孵育3小时至16小时，或直至细胞呈现蓝色（注意：避免液体蒸发） 12．在光学显微镜下观察和计数：表达β- 半乳糖苷酶的细胞为阳性细胞，呈现蓝色 13．（选择步骤）核固红复染：细胞核呈现粉红色（建议使用核固红复染试剂盒――G&VS40011） 二、 冰冻切片染色 实验开始前，将试剂盒里的染色液（Reagent E）从－20℃的冰箱里取出，放进冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀释液（Reagent D）到15毫升锥形离心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混匀后，放进37℃恒温水槽里预热，标记为染色工作液。然后进行下列操作： 1． 准备10片待测的厚为5至10微米的冰冻切片 2． 置于室温下，小心加上xx微升预冷的清理液（Reagent A），铺满整个切片表面 3． 小心移去切片上的清理液（Reagent A） 4． 小心加上xx微升预冷的固着液（Reagent B），铺满整个样品表面 5． 室温下孵育10分钟 6． 小心移去切片上的固着液（Reagent B） 7． 小心加上xx微升清理液（Reagent D），铺满整个切片表面 8． 室温下孵育5分钟 9． 小心移去切片上的清理液（Reagent D） 10． 重复实验步骤7至9一次 11． 小心加上xx微升预热的染色工作液，铺满整个切片表面 12． 在37℃湿润培养箱里，孵育3至24小时，或组织细胞呈现蓝色（注意：避免液体蒸发） 13． 小心移去切片上的染色工作液 14． 小心加上xx微升清理液（Reagent A），铺满整个切片表面 15． 小心移去切片上的清理液（Reagent A） 16． （选择步骤）核固红复染：细胞核呈现粉红色（建议使用核固红复染试剂盒――G&VS40011） 17． 放上盖玻片或封片 18． 即刻在光学显微镜下观察和计数：表达β- 半乳糖苷酶活性的地方，呈现蓝色 三、 全组织染色 实验开始前，将试剂盒里的染色液（Reagent E）从－20℃的冰箱里取出，放进冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀释液（Reagent D）到15毫升离心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混匀后，放进暗室里，室温下，标记为染色工作液。然后进行下列操作： 1． 准备1个6孔细胞培养板 2． 放进新鲜切除的动物组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，最好刀切处理一下） 3． 将组织压平 4． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本 5． 小心抽去清理液 6． 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），浸没整个组织 7． 在4℃条件下孵育2小时 8． 小心抽去固定液 9． 小心加入xx毫升净化液（Reagent C），清洗组织样本 10． 在室温下孵育15分钟 11． 小心抽去净化液 12． 重复实验步骤9至11一次 13． 小心加入xx毫升染色工作液，浸没整个组织 14． 放进37℃培养箱，孵育16小时，避免光照 15． 后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚） 16． 在光学显微镜下观察和计数：表达β- 半乳糖苷酶活性的组织细胞为阳性细胞，呈现蓝色 注意事项 1． 本产品为100次（4个24孔细胞培养板）、50次（冰冻切片）、20次（20个25cm2细胞培养瓶）或10次（全组织）操作 2． 操作时，须戴手套 3． 本产品的参数：固着剂种类和浓度、pH、生色底物的选择和浓度等达到最优化 4． 使用时，避免污染母液，否则出现絮状沉淀，影响实验效果 5． 染色工作液避免光照 6． 原始组织大小可以1厘米厚、2厘米长进行染色，但建议越小越佳 7． 用户根据实际需求，按比例配制试剂用量 8． 细胞β-半乳糖苷酶活性强，孵育3小时即显示阳性；细胞β-半乳糖苷酶活性弱，则需要孵育24小时 9． 细胞染色最长孵育时间为24小时 10． 孵育时避免液体蒸发 11． 染色时，培养箱为一般培养箱，没有二氧化碳，以防影响pH 12． 细胞质呈现蓝色为酶活性表达或报告基因阳性，而细胞核呈现粉红色 13． 全组织染色存在其染色不均匀、组织内部染色渗透困难等局限 14． 染色后的细胞样品可以在4℃冰箱里长期保存，同样须避免光照 15． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液： 操作容器 建议处理液规格 载玻片 100微升 载玻片培养皿 1毫升 35mm培养皿 1毫升 96孔培养板 100微升 48孔培养板 200微升 24孔培养板 500微升 12孔培养板 1毫升 6孔培养板 2毫升 25cm2细胞培养瓶 3毫升 16． 本公司提供系列β-半乳糖苷酶检测试剂产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定着色敏感
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