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植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦联光度法定量检测试剂盒
点击次数： 101发布时间：2021/5/21 12:18:43
- 上 传 者： 上海极威生物科技有限公司
- 上传时间： 2021/5/21 12:18:43
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资料简介： 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦联光度法定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦联光度法定量检测试剂是一种旨在通过磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶偶联反应系统中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析植物裂解样品中 PEPCase 活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等、部分或完全纯化酶样品中 PEPCase 的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。 技术背景 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate Carboxylase；PEPCase；EC4.1.1.31），属于羧基裂解酶 （carboxylyase）家属成员之一，同源四聚体，单体110Kd，广泛存在于植物、原生生物（protist）和细菌里，位于胞浆，催化碳酸氢固定（bicarbonate fixation）到磷酸烯醇式丙酮酸，产生四碳化合物草酰乙酸，释放磷酸根的反应。在四碳（C4）和景天酸代谢（crassulacean acid metabolism；CAM）等陆生植物（terrestrial plant）中，例如玉米等，其具有催化光合成碳同化作用（assimilation）和有机酸代谢，控制β-羧基化（β -carboxylation）的效率，产生NADPH，调节pH和电中性（electroneutrality），生成苹果酸以及酵解，重新捕获呼吸产生的二氧化碳等功能；在三碳（C3）或非光合成和四碳类植物中，例如水稻和小麦等，其参与回补反应（anaplerotic），为KREBS循环提供中间产物，并且提供碳类支持氨基酸合成，尤其在植物发育和种子发芽时期，调节碳和氮代谢相互作用。基于底物磷酸烯醇式丙酮酸，在二氧化碳的存在下，受到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用，获得产物草酸乙酰（oxaloacetate），进而通过苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase；MDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。其反应方式为： 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 酶促液（Reagent D） 微升 反应液（Reagent E） 微升 底物液（Reagent F） 微升 阴性液（Reagent G） 微升 产品说明书 1 份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照和反复冻融；有效保证 6月 用户自备 1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器 15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器 DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织细胞 （微型）台式离心机：用于样品预处理 200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器 分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析 实验步骤 一、 待测样品准备 1．准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定 1 克组织重量 2．（选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管 3．（选择步骤）加入 xx 毫升清理液（Reagent A）清洗 1 次 4．即刻用刀片切碎组织 5．放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管 6．加入预冷的 xx 毫升裂解液（Reagent B） 7．涡旋震荡 5 ，充分混匀 8．即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约 80 下） 9．将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管，放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 10000g 10．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到 1.5 毫升离心管 11．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 12．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用 二、 测定准备 1．准备好待测样品（例如植物裂解悬液等），置于冰槽里 2．设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 1 分钟，读数 6 次（共 5 分钟），并置零 3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度 三、 背景对照测定 1．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2．加入 xx 微升酶促液（Reagent D） 3．加入 xx 微升反应液（Reagent E） 4．加入 xx 微升底物液（Reagent F） 5．放进 30℃培养箱里静置 3 分钟 6．加入 xx 微升阴性液（Reagent G） 7．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 之内）3 8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟 四、 样品测定 1．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2．加入 xx 微升酶促液（Reagent D） 3．加入 xx 微升反应液（Reagent E） 4．加入 xx 微升底物液（Reagent F） 5．放进 30℃培养箱里静置 3 分钟 6．加入 10 微升待测样品（注意：50 微克植物裂解蛋白；样品须溶解） 7．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 之内） 8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟 五、 计算样品活性 六、 酶标仪测定 1．在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品 2．分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里 3．分别加入 xx 微升酶促液（Reagent D） 4．分别加入 xx 微升反应液（Reagent E） 5．分别加入 xx 微升底物液（Reagent F） 6．轻轻摇动 96 孔板 7．在 30℃温度下孵育 3 分钟 8．分别加入 xx 微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50 微克植物裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意： 样品须清澈） 9．轻轻摇动 96 孔板 10．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数 11．活性计算： 注意事项 1．本产品为 20 次操作，包括背景操作 2．操作时，须戴手套 3．系统操作过程中，背景测定只需 1 次 4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液 5．样品须澄清，至关重要 6．加入样品启动反应后 3 内即刻光度测定 7．测定值由高到低变化；测定可持续 30 分钟 8．光度测定后，比色皿须清洗彻底 9．样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性 10．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－4 GMS30030.1） 11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 12．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 8.0 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位 13．本公司提供系列羧化酶检测试剂产品 质量标准 1．本产品经鉴定性能稳定 2．本产品经鉴定检测敏感 使用承诺 秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。 友情提醒 IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。 订购信息 单组分订购信息 编号 名称 规格 GMS16017 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性酶耦联光度法定量检测试剂盒 20 次 GMS16017A 清理液（Reagent A） 毫升 GMS16017B 裂解液（Reagent B） 毫升 GMS16017C 缓冲液（Reagent C） 毫升 GMS16017D 酶促液（Reagent D） 毫升 GMS16017E 反应液（Reagent E） 毫升 GMS16017F 底物液（Reagent F） 毫升 GMS16017G 阴性液（Reagent G） 毫升
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