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线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒/微量法
价格：￥ 3150
品牌名称：$brandModel.Title型号： 原产地：中国大陆 更新时间：2026/10/15 11:08:43
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线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒说明书
注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理:
复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi,通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:80mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:2 mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 2mL 蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五:8mL×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 4mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂七:粉剂×1 瓶, 4℃保存;临用前加入 10mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂八:粉剂×1 瓶, 4℃保存;临用前加入 10mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂九:液体 10mL×1 瓶,室温保存。
定磷试剂的配制:按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。
注意:配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 800uL 试剂二和 8uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤:
1、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)
混匀，室温静置 10min 后，在 660nm 处读取 A 测定管和 A 对照管，计算 ΔA=A 测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
复合体Ⅴ活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为 y = 1.274x + 0.004;x 为标准品浓度(mmol/L),y 为 A 值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T
=50.7×(ΔA-0.004) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T
=0.101×(ΔA-0.004)
V 反总：反应体系总体积，1.2×10-4L； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.637x + 0.004;x 为标准品浓度(mmol/L),y 为 A 值。
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T
=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反总×106]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T
=101.5× (ΔA-0.004) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T
=0.203× (ΔA-0.004)
V 反总：反应体系总体积，1.2×10-4L； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
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