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酵母线粒体膜蛋白提取试剂盒
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详细内容
酵母线粒体膜蛋白提取试剂盒
产品货号:XY9-31582
产品规格及价格:50T/900元;100T/1600元
产品简介:
酵母线粒体膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂,适用于从各种酵母样品中提取线粒体膜蛋白。提取过程简单方便。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解线粒体膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒提取的膜蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白,下游应用范围广,提取液裂解细胞的能力较温和,需要根据实际样本情况优化裂解时间。
本试剂盒中不含有EDTA,与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的膜蛋白样本含有高浓度的盐成分,不可直接用于2D电泳,如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳,请使用其他货号的试剂盒。也可以将样品除盐后再用于2D电泳,用脱盐管脱盐处理。
可以提供各种蛋白质提取、裂解、酶活测定、细胞器分离、免疫组织化学、蛋白表达、蛋白标记等蛋白质相关试剂盒产品。
可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、藻类、液体、土壤等各种不同样本的蛋白提取试剂盒。
可以提供针对细胞膜、核、胞质、线粒体、溶酶体、高尔基体、内质网、外泌体等细胞不同部位的蛋白提取试剂盒。
可以提供针对下游实验不同应用的试剂盒,例如用于Western Blotting和双向电泳等不同下游应用的试剂盒;含去垢剂成分和不含去污剂成分的蛋白提取试剂盒;专用于蛋白质谱检测、Pull-down实验的试剂盒等总计300多种蛋白提取试剂盒供选择使用。
可以提供针对动物、植物等不同样本的细胞核、线粒体、溶酶体、叶绿体、外泌体等不同细胞器的提取试剂盒。
可以提供蛋白浓缩、脱盐、沉淀、透析、定量、电泳、纯化、检测等不同蛋白样品处理检测等相关试剂盒。
产品应用:
WB,IP 等

使用方法:
使用注意事项:
1.预实验很重要。必须要做预实验,在正式实验之前取少量样本优化实验条件,并像正式样本一样认真进行,看实验结果是否可行,实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性,不同样本的实验条件通常差异较大,同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同,为了避免浪费正式样本和试剂,一定要提前预实验优化实验条件。
2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
3.实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4.提取液D在使用前须一直置于2-8℃条件,否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
1.提取液准备:每500 µl冷的酵母线粒体膜蛋白提取液D中加入2 µl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
【注】:根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完,再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时,注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。提取液 D 在使用前须一直置于 2-8℃条件,否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2. 酵母培养物,在4℃,1000×g 条件下离心 5-10 分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集酵母沉淀。
3.用 PBS 洗涤酵母两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
【注】:在 1000×g 离心 5 分钟。4. 每 100-200 µl 体积或 100-200 mg湿重酵母沉淀物中加入 400 µl 酵母线粒体提取液 A,混匀后,在 30℃条件下保温 15 分钟。
【注】:酵母数量根据实验情况调整,每次的裂解液用量并不是一定的,请根据实际情况调整。由于膜蛋白含量较少,需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下,尽可能加大细胞上样量。5. 在 1000×g 条件下离心5-10 分钟,收集酵母沉淀。6. 酵母沉淀物中加入 500µl 酵母线粒体提取液 B,充分混匀后。
【注】:根据酵母细胞量调整提取液用量,一般加菌体体积的 2-5 倍均可。按酵母菌体体积每 100 µl或 100 mg 湿重菌体加入 250-500 µl 提取液。7. 在 37℃或室温条件下轻微振荡 30-90 分钟。
【注】:使用振荡器/摇床的较低转速,提取液能轻微晃动即可。x没有振荡条件也可以不振荡,稍微延长提取液的处理时间,中间每隔 10 分钟用移液器吹打混匀。不同酵母样本需要的时间差异较大,根据下游细胞裂解的难易程度调整,如果下游试剂 C 处理后沉淀没有明显减少,需要延长此步骤处理时间。可以延长至 2 小时。8. 在 2000×g 条件下离心 5-10 分钟,弃上清,收集沉淀。9. 沉淀用 PBS 洗涤两次。离心收集沉淀。
【注】:在 2000×g 离心 5 分钟。10.在沉淀中加入 800 µl 酵母线粒体提取液 C,充分混匀,然后在振荡器上振荡 15-30 分钟。
【注】:用振荡器/摇床的较低转速,保持提取液有轻微晃动即可。没有振荡器的话,在 4℃静置,稍微延长处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。试剂C 处理后沉淀应减少,否则延长处理时间。
11. 在 4℃,500×g 条件下离心 5 分钟,弃沉淀,收集上清。
12.将上清在 4℃,1000×g 条件下离心 5 分钟,弃沉淀,收集上清。
13. 将上清在 4℃,14000×g 条件下离心 20 分钟。弃上清,留沉淀。
14. 在沉淀中加入 200-400 µl 冷的线粒体膜蛋白提取液 D,充分混匀。
【注】:提取液 D 在使用前须一直置于 2-8℃条件,否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
15.在 2-8℃条件下振荡 20-40 分钟。
【注】:此步骤必须在 2-8℃条件振荡。使用振荡器/摇床的较低转速,提取液能轻微晃动即可。没有 2-8℃振荡条件也可以不振荡,置 2-8℃静置,稍微延长提取液的处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。16. 在 4℃,12000×g 条件下离心 5 分钟。
【注】:此步骤必须在 2-8℃条件离心。
17. 将上清吸入另一干净离心管,在 37℃水浴 5-10 分钟。
18.在 37℃,1000×g 力离心 5 分钟,此时溶液分为两层,下层是膜蛋白约为 20-40 µl。
【注】:此步骤必须在 37℃条件下离心。没有 37℃离心条件也可以不离心,稍微延长 37℃水浴时间,至液体澄清,分层清晰。由于两层均为无色液体,分层可能不清晰,需对着光线仔细观察。
19.小心移除上层,留下下层即为线粒体膜蛋白。20.用 50-100 µl 膜蛋白溶解液 E 溶解下层,即得到酵母线粒体膜蛋白样品。
【注】:膜蛋白比较难溶解,不能很快溶解混匀,可以在加入溶解液后稍微吹打混匀,然后置于 4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。于 4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。21. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】:建议用 BCA 法进行蛋白定量。。蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
常见问题分析:
1.蛋白浓度低?
酵母线粒体膜蛋白丰度极低,在条件允许的情况下,需要尽可能加大酵母细胞的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂BCD的处理时间即可。在持续振荡的条件下处理,没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白?
建议用BCA法。不适合用Bradford法,因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份,导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系,则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗?
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份,不破坏蛋白的结构,没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏,蛋白均保持其天然构象和活性。
4.膜蛋白电泳没有条带?
膜蛋白样品通常浓度较低,电泳前一定要进行蛋白定量,以保证电泳是蛋白上样量足够。膜蛋白提取好后,用溶解液充分溶解后,可以超声处理一下,再进行蛋白定量。蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸,采用50℃保温30分钟。蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。有些样品的膜蛋白含量太低,可以使用丙酮沉淀膜蛋白,再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中,一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时采用低电压低电流电泳。膜蛋白丰度通常较低,有条件可以尝试用银染染色。
仅用于科研,不能用于临床诊断!所有产品仅供科研使用,不得用于人或动物的治疗等任何其他用途,不为任何个人提供产品和服务。以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。
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