进行 RT-PCR 实验时，对样本有哪些要求？

样本最核心的要求是RNA 尽量完整、无明显降解，无 RNase 污染，杂质与基因组 DNA 干扰可控。

样本采集与离体处理方面，组织样本离体后要快速处理，尽量在几分钟内放入液氮速冻或者 RNA 保护液，室温放置时间越短越好，防止内源 RNase 降解 RNA。细胞样本吸弃培养基后，可直接加裂解液，或者离心收集细胞沉淀，快速冻存。体液样本收集后及时离心去除细胞碎片，分装保存，避免反复冻融。

样本保存条件，所有样本建议分装成单次实验用量，避免反复冻融。短期保存可放 4℃数小时；长期保存，组织、细胞沉淀放负 80℃。不要放在冰箱门位置，温度波动大容易降解。样本不能反复解冻冻融，每一次冻融都会加速 RNA 断裂。

RNA 质量要求，提取后的 RNA 需要检测纯度与完整性。A260/A280 比值在 1.8 至 2.1 区间较为合适，比值偏低提示蛋白或者酚类残留，偏高一般无明显影响。A260/A230 比值建议大于 2.0，比值过低代表多糖、酚类、盐离子等杂质残留，会抑制逆转录和 PCR 酶活性。同时评估 RNA 完整性，琼脂糖电泳或者毛细管电泳观察条带，完整总 RNA 会有清晰的核糖体 RNA 条带，条带弥散说明 RNA 严重降解，不适合 qPCR。

抑制物控制，样本中残留的血红蛋白、多糖、酚、乙醇、高浓度盐离子都会抑制逆转录酶与 Taq 酶。组织样本尤其是骨、植物样本，要重点去除这类杂质；血液样本避免严重溶血。若存在抑制物，会出现扩增效率下降、Ct 值异常偏大。

基因组 DNA 污染控制，样本尽量减少 gDNA 残留。提取 RNA 时可选用带 DNase 处理的方案。后续实验必须设置无逆转录酶对照，用来判断残留基因组 DNA 会不会产生扩增信号，区分信号来自 mRNA 还是基因组 DNA。

样本用量，根据靶基因丰度调整 RNA 上样量，不要过高。模板过量会抑制逆转录反应，一般单管逆转录总 RNA 推荐范围在 0.1μg 至 2μg。浓度过低的样本可以增加上样量，但需要保证纯度。

其他注意点，样本不能带有外源 RNase 污染，操作全程使用无 RNase 耗材。样本如果发生细菌、真菌污染，微生物释放大量 RNase，会快速降解样本 RNA，这类样本不建议使用。

精简版（可直接粘贴）：
RT-PCR 样本需保证 RNA 完整性，离体组织迅速液氮速冻或置于 RNA 保护液，细胞与体液样本及时处理。样本分装保存于 - 80℃，避免反复冻融。提取后检测 RNA 纯度，A260/A280 控制在 1.8~2.1，A260/A230 大于 2.0；电泳评估 RNA 完整性。尽量去除血红蛋白、酚、多糖等 PCR 抑制物，必要时 DNase 处理降低基因组 DNA 干扰；同时设置无逆转录酶对照。控制逆转录的 RNA 上样量，避免模板过量抑制酶促反应；微生物污染、RNA 严重降解的样本不可使用。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司