自动化液质联用实现高通量溶液内酶解和多肽纯化

适用于液质联用 (LC/MS) 分析的蛋白质和多肽样品前处理的工作流程由于依赖于连续 的手工操作而效率低下，导致试验方案缺乏通量、可扩展性和可转移性。这类工作流程 通常依赖于技能非常娴熟的从业人员以达到可接受的重现性，或者在很多情况下，鉴于 工作流程的特殊性，较大的差异是可被勉强接受的。为解决这些问题，可以采用安捷伦 AssayMAP Bravo 平台及其蛋白质组学工具套件实现 LC/MS 蛋白质组学工作流程常规 样品处理工作的自动化，使 LC/MS 样品前处理具有可重现性、可扩展性、方案可移植性 和易用性。本平台由的液体处理器、一次性微量色谱柱和简单的用户可定制方案组 成，可高通量地进行蛋白质酶解和多肽纯化。BSA 经酶解后纯化所得的分析性能数据表 明 25 种 BSA 目标多肽的日间重现性良好， % CV 小于 5% 此外，我们还展示了用于多肽 纯化的 AssayMAP RP-S 和 C18 反相柱的所有特性。

蛋白质和多肽分析经历了一场变革，部分原 因是由于串联质谱、软电离技术、生物信息 学和色谱分离技术的进步。分析革新和运算 能力的融合，使科学家们得以利用液相色谱 与质谱联用 (LC/MS) 的工作流程探索蛋白 质动力学和具有空前灵敏度和精密度的定量 测定方法。随着 LC/MS 在定量蛋白质组学 领域的应用日益成熟，人们对分析精度的要 求将更严格，对提高样品通量的愿望更强烈。 然而，虽然 LC/MS 在蛋白质组学的应用已 取得了巨大创新，但是样品前处理的发展未 能与其它关键技术并驾齐驱。在生物标记物 发现和验证领域，没有哪项技术像定量蛋白 质组学的样品前处理技术一样发展得如此明 显缓慢。据文献报道，利用 LC/MS 测定已 揭示了数百种有关疾病的潜在蛋白质生物标 记物并且记录在案。但是，其中绝大多数生 物标记物的研究仍然止步于最初的使用一小 组患者样品的研究。这些样品组通常比日常临床应用的分析验证所需的样品数少几个数 量级。由于通过多步骤工作流程对患者样品 进行单个或小批量处理会导致多重误差，因 此在企图扩大样品处理规模时通常伴随着检 测变异增大。这种变异会掩盖蛋白质表达中 具有重大生物学意义的变化，初步研究表明， 这些变化能够指示疾病的状态和易感性。

采用 LC-MS 进行定量蛋白质组学的样品前 处理工作流程由于依赖于连续的手工操作而 效率低下，导致试验方案缺乏通量、可扩展 性和可转移性，而这些特性正是 LC/MS 临 床应用和高通量筛选及过程控制工作流程所 必须的。这些工作流程通常依赖于数量相 对有限的技能相当娴熟的从业人员以达到可 接受的重现性，虽然保持了所期望的分析质 量，但却严重限制了增加样品处理容量的能 力。能否成功利用 LC/MS 进行蛋白质分析， 样品前处理的重现性非常重要。直观、可靠 和样品可扩展的自动化方案的欠缺进一步限 制了 LC/MS 在需要进行大量样品处理或要求高通量的分析中的应用。因此必须对样品 前处理方法进行开发，使其能够从根据假说 进行研究扩展至完整的临床验证和大规模检 测。此类扩展能否实现取决于其所基于的自 动化方案是否专门设计用于蛋白质样品前处 理，重要的是能否满足蛋白质组学研究者们 的需求。

本应用简报展示了专为实现可重现、可扩展 并且简单易用的 LC/MS 样品前处理而设计 的安捷伦 AssayMAP Bravo 自动化平台及 其蛋白质组学工具套件。该平台包含配有 96 个探针式注射器的能够实现正向位移式精 确流量控制的液体处理器、一次性 5 µL 填充床色谱柱、灵活并且可自定义的分析方 案以及简单的用户界面，可在微孔板中进行 自动化的、高通量的蛋白质酶解和多肽纯化。 本文将介绍 AssayMAP Bravo 在单一蛋白 质模型系统的酶解和纯化中的应用，并报道 了复合工作流程所得的分析性能数据。

实验部分 溶液内酶解 在溶液内酶解方案中，用户可以选择平行处理 1-4 个 96 孔板的 1-12 列中的样品（8–96 个样 品/板）。在本实验中，每板可处理 32 份样 品。在本方法中，首先依次从适当的母板吸 取试剂，然后将试剂加入到样品中并在样品板 中将溶液混合，具体数量则遵照应用界面输 入的参数（图 2）。通过应用界面开启或关闭 步骤并改变不同试剂的组成以定制反应条件， 从而提高了系统的灵活性。将牛血清白蛋白 (BSA) 在水中溶解使浓度达到 15 µg/µL，吸 取 15 µL (225 µg) 至 U 型底微量滴定板的前 四列的各个孔中。在另外 3 个板上重复上述 操作，从而产生 4 个样品板，总计有 128 份 独立样品进行酶解。将胍基变性剂混合物分 配至第 1 和 2 列并将脲基变性剂混合物分配 至第 3 和 4 列，由此制成变性混合物板。将 碘乙酰胺添加至 U 型底烷基化板的前 4 列中， Tris 缓冲液添加至 1 mL 深孔稀释剂混合物 板的前 4 列中以及胰蛋白酶添加至 PCR 蛋 白酶板的前 4 列中。板的布局见图 1，试剂 列表见表 1。

采用溶液内酶解方案中的微孔板堆栈工具在 AssayMAP Bravo 台板的位置 2 将 5 个 U 型 底板堆成一摞，以充当各个样品板和蛋白酶 板的顶盖。这些板在烷基化步骤中可使样品 避开光照并地降低了大气污染的风 险。它们还能够在各个液体处理步骤之间提 供严格的注射器清洗（本实验未进行严格的 注射器清洗）。将试剂和样品板放置于台板 上，如图 2 所示。在“溶液内酶解”用户界 面的“应用设置”中输入图 2 中显示的数值。 启动本方案，加入变性剂混合物并与样品混 合。本方案可自动中止，以便将样品板从 台板上移除。通过 PlateLoc 利用可移除的密封膜对样品板进行密封并在 60 °C 培养箱 中放置 1 h。样品板经短暂的离心，除去密 封膜，样品返回至台板上，继续加入烷化剂， 进行烷基化温育 (45 min)，然后加入稀释剂， 再加入胰蛋白酶，这些操作均在 Bravo 台 板上连续进行。方案步骤完成后，将样品 板从台板上移除，使用 PlateLoc 密封并置 于 37 °C 培养箱中酶解过夜。将样品从培养 箱中取出，短暂离心，利用单一液体添加工 具向各个样品板加入 30 µL 10% TFA 使样品 酸化。第二天，采用相同条件重复溶液内酶 解方案。然后，利用多肽纯化方案处理酸化 的 BSA 酶解物。

多肽纯化 AssayMAP 提供了两种可选小柱进行反向 纯化，一种小柱装填了传统的 C18（16% 碳 载量，150Å 孔径）固定相，另一种装填了 未衍生聚苯乙烯-二乙烯基苯固定相（RP-S， 100Å 孔径）。每种类型的小柱在选择性方面 可能会显示细微差异，这取决于样品和所选 的试剂。此外，C18 柱在大约 pH 2–8 范围 内具有稳定的性能，而 RP-S 柱具有更宽的 pH 操作范围（约 pH 1–13）。

多肽纯化方案从 Workflow Navigator 打开。 将缓冲液（表 1）分配至与储存注射器清 洗（灌注）缓冲液、通用缓冲液（平衡/清 洗）或洗脱缓冲液的试剂板相对应的 12 列 板的前 4 列。空 U 型底板或 PCR 板用作流 通液收集板和洗脱液收集板。色谱柱转换器 用于将四列 AssayMAP C18 柱（天） 或 RP-S 柱（第二天）从柱架转移至第 2 板 位的柱放置台板上。台板的配置如图 3 所示， 第 4 板位放置了含酸化 BSA 的单个 U 型底 样品板。在“多肽纯化”用户界面的“应用 设置”中输入数值并在“实验室器具表”中 选择实验室器具类型（如图 3 所示）。启动 方案并在柱灌注和平衡后，向各个小柱加载 100 µL BSA 酶解物 (75 µg)。对通过溶液内 酶解方案所得的另外 3 个样品板重复多肽纯化方案。将洗脱物冻干并在 –80 °C 下保存。 将洗脱物复溶，从各个样品孔取 1.25 µg 进 样。利用 LC/MS 监测 25 种多肽的信号。 多肽纯化 — 回收率 在多肽纯化回收率研究中，将通过溶液内酶 解方案所得的酸化 BSA 酶解物 (0.75 µg/µL) 混合并稀释成以下系列浓度：0.75、0.50、 0.25、0.125、0.0625 和 0.03125 µg/µL。采 用图 3 中的设置对样品进行多肽纯化，同时， 取 100 µL 各浓度溶液加载至 AssayMAP C18 柱上，平行操作 3 次。将洗脱物冻干并在 –80 °C 下保存。将洗脱物复溶，取各加载浓 度溶液所得样品 0.5 µg 进样。利用 LC/MS 监测 25 种多肽的信号，并直接与各个浓度的 0.5 µg 酶解物经在线 LC 纯化所得的相同多肽的峰面积对比。（最高至最低浓度的 BSA 溶 液的进样体积范围为 0.67 µL 至 16 µL）。 多肽纯化 — 载样量的差异 为进行多肽纯化载样量差异的研究，将来自 批量溶液内胰蛋白酶酶解物的酸化 BSA 酶 解物 (4.75 µg/µL) 稀释为以下系列浓度： 4.0、3.0、2.0、1.0、0.75、0.50、0.25 和 0.10 µg/µL。采用图 3 中的设置对样品进行 多肽纯化，同时，取 100 µL 各浓度溶液加载 至 AssayMAP RP-S 和 C18 柱上，所有样品 平行制备 2 份。将洗脱物冻干并在 –80 °C 下保存。将洗脱物复溶，取各加载浓度溶液 所得样品 1.0 µg 进样并利用 LC/MS 监测多 肽信号

结果与讨论 溶液内酶解和多肽纯化 通过 LC-MS 对第 1 天（C18 柱纯化）和第 2 天（RP-S 柱纯化）所得的 BSA 酶解物进 行分析。使用 LC/MS 获得了 BSA 的 25 种 代表性胰蛋白酶消化肽段的提取离子色谱 图 (EIC) 并绘制了各个多肽的峰面积。图 4 （顶部）显示了胰蛋白酶酶解的 5 种 BSA 多 肽（胍类变性剂）的峰面积，追踪时间为 128 份样品酶解和纯化处理的那两天。所 有重复试验所得的多肽的 % CV 在 1.3% 至 2.5% 范围之内。图 4 中的表格总结了按天 和变性剂分类的 25 种多肽的 % CV 分布情况。 两日均以尿素为变性剂时，25 种 BSA 多肽 的平均 % CV 小于 3.7%，以盐酸胍为变性剂 时平均 % CV 小于 2.6%。结果显示，从酶解 和纯化到 LC/MS 分析的整个工作流程，这 些多肽的信号具有显著的一致性。由多孔板 数据证实了分析的一致性，因此能够实现高 通量的样品前处理，溶液内酶解的平行处理 容量可扩展至 384 份样品。同样，96 份样 品可同时进行多肽纯化。在任何一种情况下， 通量需求可轻松扩展至每周处理数十、数百 至数千份样品。 虽然监测的大多数多肽的 % CV 值较低，但 并不表示每种从 BSA 所得的多肽在两种酶 解条件下均得到了理想的处理。在某些方面， 这体现了蛋白质酶解的复杂性，即特定的条 件可能有利于或不利于某些多肽的释放。例 如，肽 FKDLGEEHFK 含有一个通过天冬氨 酸残基侧接在其 C 末端的位于赖氨酸残基 上的未裂解基团，这是一个已知的会减缓某 些蛋白质的胰蛋白酶酶解速度的基序。在 LC/MS 的靶向定量应用中，这并不是一个 理想的肽，但是有时非理想的肽可能是进行 定量的选择。在这种情况下，多反应监测实验表明与裂解完全的肽 DLGEEHFK 相 比，肽 FKDLGEEHFK 产生了 4 至 5 倍以上 的信号，并且生成了更高 m/z 的 y 离子而 具有更强的专属性。然而，两日均采用脲 基变性剂的峰面积 % CV 为 39.2%，但日 内 % CV 为 5.5% 和 8.8%，这表明变性条 件较差。两日均采用胍基变性剂的峰面积 % CV 为 5.8%，日内 % CV 为 2.5% 和 1.9%。 由于 AssayMAP Bravo 平台具有很高的样 品多重监测功能，使人们可以平行地评估变性条件，发现有助于非理想的目标肽生成一 致性产物的条件。为便于快速确定有利于 各自蛋白质释放一致的目标多肽的变性条件， 可以滴定不同浓度的多种变性剂至变性剂混 合物板。此外，由于样品前处理可以在不同 板上平行操作，因此可以在各个样品板上评 估变性条件并单独温育。通过一种强大的并 行方式对变性时间和温度以及变性溶液的组 成同时进行优化，以此加速方法开发。

来源：上海斯迈欧分析仪器有限公司