SITC实践指南（共识一）：多重免疫组化有多种，不止TSA-mIHC

肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的组成、功能蛋白的表达模式、基质细胞的空间分布，与疾病预后和免疫治疗响应关系紧密。比如肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达水平、治疗前肿瘤标本中存在的CD8+ T细胞浸润密度，均与免疫检查点抑制剂治疗效果相关。对治疗过程中采集的样本进行研究，有助于筛选出稳定可靠的新型生物标志物。

常规免疫组化（IHC）仅能检测单一标志物，流式细胞术需要新鲜组织且会丢失空间信息，DNA、RNA多组学与单细胞测序技术同样存在丢失空间信息的可能，这些局限让我们难以系统解析TME的复杂结构。多重免疫组化（mIHC）或多重免疫荧光（mIF）能在单张组织切片上同步检测多种标志物。在一项荟萃分析中，mIHC/mIF的性能在预测抗PD-L1疗法的客观疗效方面显著优于其他技术，凸显共表达与空间分布的潜在价值。

mIHC/mIF技术多样、操作流程复杂，主要采用两种方式进行：一是在切片上一次性加入多种标记物，二是染色-洗脱循环。其暂无统一的实验规范和验证标准，存在结果重复性差问题。为解决这一痛点，癌症免疫治疗学会（SITC）召集学术界、制药企业、诊断行业的病理专家、技术专家，系统梳理了5类主流技术的特性，建立了涵盖抗体验证、染色优化、方法学验证的全流程规范，为科研和临床转化应用提供参考。

一、主要技术路线的差异化与适用场景

1、多重显色免疫组化

这种技术的检测原理与实验流程与常规IHC相同，仅是通过不同颜色的显色底物在同一张切片上标记3-5个标记物。如图所示，分别使用紫色HRP、黄色AP和蓝绿色HRP的显色底物以及苏木素复染，半定量分析FOXP3、CD8、KRT三个靶点的分布情况。

多重显色免疫组化实验体系优化的中心是提升信噪比，改进方案也与常规IHC雷同，比如延长抗体孵育时间，在不影响特异性的前提下降低一抗工作浓度，信号过弱或检测体系灵敏度不够可延长抗原修复时间或聚合物放大试剂的作用时间。表达水平低的标志物建议使用酪胺信号放大技术（TSA）。

在同一张切片上同时进行多重显色染色受到显色底物的限制，因为性能差异、可用于标志物共表达的底物十分有限。这种技术的信号强度动态范围也受限，因此其大多用于判断阳性或阴性表达，或者进行半定量H-score评分。

图1 多重显色免疫组化的光学显微镜结果（源自文献）

2、单张切片多重免疫组化连续染色（MICSSS）

MICSSS是在同一张切片上循环进行“抗体孵育、染色、图像扫描、显色底物脱色、抗体洗脱”等多轮免疫染色过程。该技术与单标IHC存在许多相同的步骤，每完成一轮染色后用光学显微镜或扫描仪完成全切片扫描，随后去除盖玻片、清除显色底物，并完成抗体洗脱和封闭，然后进行下一轮的单个靶点的IHC染色。

MICSSS单张可检测10个左右的标志物，除需要满足单标IHC的要求外，还有一些特殊要求。显色底物需溶于乙醇等溶剂，便于清除，常用AEC。还需要重复进行抗原修复，确保上一轮的抗体被完全去除和封闭，比如甘氨酸-SDS、potassium permanganate‌处理以及序贯染色中用于洗脱抗体Fab片段的封闭法。

MICSSS对抗体及染色顺序要求严格。即使已完成验证和优化的抗体，在新增待检标志物时仍需开展大量的验证测试。每一个新增标志物都需完成单标IHC实验优化，还需将全部标志物与各自单标IHC染色结果从头开展对比，进行染色顺序的排列组合测试，确保检测体系的灵敏度和特异性。有些表位经历10轮循环染色仍可保留，但有些表位对洗脱处理十分敏感。敏感的标志物应排在靠前的轮次，尽量减少甚至不经历抗体洗脱步骤。

MICSSS主要缺点在于十分耗时。一套包含10个标志物的检测需求，要完成10轮循环，每轮循环需要1-2天。在此期间，反复揭除盖玻片还可能破坏切片组织结构，会对后续的染色及图像分析产生连锁影响。

MICSSS的技术难点在于图像拼接融合，生成可分析的多重全切片图像。首先需要借助软件对序贯获得的单标图像进行配准对齐，减少并校正每轮染色后切片发生的微观变化及切片移位带来的偏差。每轮染色获得的图像以褐色为主，需要进行色彩反卷积、颜色转换（伪荧光处理）等一系列处理步骤，最终生成多彩的图像。

图2 MICSSS技术流程及染色结果（右下方为伪彩处理后的合成图像）

3、多重免疫荧光（mIF）

多重免疫荧光是目前科研领域应用较广泛的技术路径，通过多轮染色-洗脱循环，结合多光谱成像信号，在单张切片上定量检测5-8个标志物。mIF的一抗信号可采用直接或间接荧光基团标记，使用活性荧光基团、DNA条形码、量子点等多种材料，波长在350-750nm区间。

TSA信号放大技术是mIF应用较广泛的间接标记方案。该体系借助聚合物-HRP系统激活酪胺荧光基团。被激活的酪胺与酪氨酸残基发生共价结合，结合于靶蛋白表位及其周边。随后通过热处理系统该靶标对应的非共价结合一抗-聚合物-HRP复合物，而与酪胺偶联的荧光基团被保留在组织上。之后进入下一轮的抗体孵育染色，并使用另一种酪胺偶联荧光基团完成信号显示。

mIF本质上是将多套单重IF实验整合为一套，操作步骤基本与单重IF一致。从单重到多重，各个标志物的信号强度可能会升高或降低，因此需要进一步优化抗原修复条件（缓冲液pH值、温度）、试剂浓度（一抗、二抗、荧光基团等）、孵育条件（时间、温度）、封闭以及靶标的检测顺序。

一般建议：表达水平高的靶点选用低亮度的荧光基团，低表达靶点选用高亮度荧光基团。一抗条件摸索时，初始孵育条件通常为室温、孵育30min，TSA荧光基团初始稀释比为1:100。这两个独立变量应当分开进行测试。染色排序还应考虑“伞效应”（即TSA与抗原周边位点结合抑制后续一抗的结合），常发生在多个标志物定位于同一细胞区室时。比如CD3、CD8、PD-1均表达于T细胞膜表面，如果先检测CD3或CD8，大量酪胺沉积可能封闭PD-1位点。将多重检测结果与单重IHC/IF结果对比，可识别这种情况。

目前已有数百种商品化的荧光基团，促进了mIF的应用。大部分文章选取切片的5-10个感兴趣区域（ROI）进行检测。该技术还可将一抗与DNA条形码进行偶联，通过原位聚合反应、渗入荧光dNTP类似物进行检测，理论上可将标志物数量提升至30-60个。

图3 基于TSA检测技术与多光谱成像的mIF

4、基于组织的质谱成像

基于免疫组化的质谱技术（EMS-IHC或MS-IHC）是解析生物样本蛋白质空间分布特征的重要技术之一，比如用于阐明1型糖尿病的自身免疫机制、明确边缘区B细胞的表达特征及研究单细胞表型与肿瘤微环境的组织形态学关联性。

EMS-IHC的试剂配制、蛋白封闭、抗原修复、染色步骤等与常规IHC一致，但不使用HRP显色体系。EMS-IHC可直接在切片上检测偶联于一抗的金属同位素。该方法可将多至40种的不同抗体配制成预混液，一步完成染色，且不需要借助二抗进行酶促信号放大。样本完成染色后，将切片送入质谱仪。对ROI区域内的组织进行逐像素电离，每个像素产生的离子通过飞行时间（TOF）质谱进行分析。提取每个像素中各元素报告分子的丰度即可重构组织图像，比如一套40种标志物的Panel会生成40张灰度图像，单张图像内的像素强度即对应靶点的表达丰度。

图4 EMS-IHC检测结果图（含6色叠加图及同步采集的部分标志物的双色放大图）

5、数字空间质谱分析（DSP）

DSP依托GeoMx™平台运行，在不破坏样本的前提下对特定感兴趣的目标区域（ROI）内的蛋白实现高通量同步定量检测。DSP可对同一组织切片的核酸和蛋白质进行共检测，将组织病理学、肿瘤免疫和表达图谱结合。

DSP通过标准的IHC方法，将成像试剂（荧光标记一抗）、定量试剂（DSP条形码标记的一抗）和组织切片进行混合孵育和染色。通过DSP配套成像软件对ROI进行圈选，还可根据荧光基团划分特征区域（AOI）。紫外照射后光解并收集ROI中的DSP条形码，通过NanoString™技术完成计数。比如在CD68标记的ROI区内，可检测50种带紫外可裂解标签的抗体。

图5 数字空间质谱分析（DSP）。A，多重免疫荧光图像；B，非小细胞肺癌组织芯片（绿色：角蛋白CK，黄色：CD45，蓝色：CD68）；C，AOI区特定标志物的信号量。

二、多重免疫组化的全流程标准化原则

癌症免疫治疗学会（SITC）行业共识提出，多重免疫组化的优化和验证需要以成熟的单标IHC为对照，多重检测体系能重现单标结果。围绕这一原则，共识从3个核心维度建立了规范。

1、抗体验证

免疫组化或免疫荧光检测实验中，靶向目标生物标志物的一抗是关键。单抗具有更高的特异性和可重复性，并建议对其性能进行验证。检测抗体特异性的方法有多种，比如转染靶蛋白的细胞系或天然可表达靶蛋白的细胞系，以及敲低靶蛋白的细胞系、转染同一家族不同分子的细胞。除了细胞系还需要在组织样本中进一步验证抗体。若观察到细胞出现非预期染色，可采用正交方法（如原位杂交）验证，确认抗体标记的细胞中存在靶蛋白RNA。

通过靶蛋白不同表达水平的细胞系可以验证抗体灵敏度及实验的动态范围。混合多种抗体有助于提升靶蛋白信号强度，比如混合不同抗细胞角蛋白抗体用于检测总细胞角蛋白，将CD68、CD163、CD11b等抗体混合，标记同一种荧光基团，可用于对巨噬细胞定量检测。

2、完善的对照设置

每一批染色实验都需同步进行阳性和阴性对照。一块组织（以正常扁桃体为例）可同时充当阳性对照和阴性对照，如PD-L1在隐窝上皮、可染小体巨噬细胞、其他滤泡组织细胞、散在的滤泡间巨噬细胞和少量淋巴细胞中呈阳性，在其余细胞呈阴性。对照也可以通过组织芯片实现。

3、规范的方法学验证

从单标染色到多重染色，需要评估标志物间的相互干扰，优化抗原修复条件、试剂浓度、染色顺序、抗体孵育条件等。对于易产生封闭效应的TSA技术，可通过单标缺失对照确定干扰来源，调整染色顺序、优化试剂浓度等解决问题。

文章总结了5条多重免疫组化（mIHC）/免疫荧光（mIF）检测体系优化与验证核查清单：

• 针对每个靶点优化单标IHC染色方法，进行一抗筛选，设置阳性与阴性对照。非聚合物信号放大体系需保证同型对照结果为阴性。对一抗、二抗试剂进行滴定优化，在不影响灵敏度的前提下，确保最佳信噪比。

• 确保多重检测组合（Panel）各标志物的染色结果与单标IHC结果一致。

• 开展多批次、不同日期的重复性验证实验，并出具结果报告。

• 每一批次实验都需要同步检测每个标志物对应的阳性与阴性对照。

• 若调整多重免疫组化Panel的靶点顺序、更换抗体的荧光基团或新增/移除抗体，需要对Panel重新进行验证。

参考文献：
Taube JM, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. doi:10.1136/jitc-2019-00155

来源：北京义翘神州科技股份有限公司