近年来，寡核苷酸 (Oligonucleotides, OGN) 药物已成为一种能够精确有效地调节基因表 达的治疗药物，它是继小分子药物和蛋白质药物之后出现的一类新型药物。当前正在开 发中的 OGN 包括反义寡核苷酸 (ASO)、小干扰 RNA (siRNA）、适配体 (aptamers) 和微小 RNAs (miRNAs) 等。其中，单链 ASO 和双链 siRNA 是最常见的 OGN 疗法[1-3]。在药物研 发和药理、药代实验过程中，我们需要强大的生物分析工具对 OGN 在生物基质中进行 定量分析并研究其相关药理特性。三重四极杆液质联用 (LC-MS/MS) 分析技术由于具有 灵敏度高、线性范围宽、选择性高、特异性强等特点，在近年里越来越多被应用于 OGN 的定量分析[4-5]。Aowen Liu 等在一篇文献里总结，截止 2022 年上市的 16 种 FDA/EMA 批准的治疗性 OGN 中，LC/MS 用于其中 9 种 OGN 的生物分析，特别是最近三年批准 的 OGN，其中 LC/MS 技术是不可或缺的。寡核苷酸药物具有亲水性强、高度负电性、 修饰类型多样等特点，因此对 OGN 进行的 LC/MS 方法开发与优化，主要是通过选择不 同的流动相添加剂来改善色谱分离和质谱灵敏度。常见的流动相添加剂是采用离子对试 剂六氟异丙醇 (HFIP) 结合不同类型的胺，如三乙胺 (TEA)、N-乙基二异丙胺 (DIPEA）、 三丁胺 (TBuA) 等[6-7]。离子对试剂的使用会带来信号抑制、高残留、非特异性吸附等问 题，需要专业的技术团队对色谱、质谱、样品前处理等条件进行优化，以建立合适 的分析方法。安捷伦生物制药应用团队针对 OGN 药物生物样品分析中的难点和要点， 从自动化样品处理、色谱柱与流动相选择、质谱条件优化等方法开发全流程进行系统性 梳理，帮助我们的用户更快适应 OGN 药物生物分析的挑战。 本文介绍了在生物样品中 OGN 药物 LC/MS 方法开发常见的问题及优化方案。使用定 制合成的无生物活性的 siRNA 序列作为对照品，模拟血浆作为空白基质，参照中国药 典《9012 生物样品定量分析方法验证指导原则》进行部分方法学确认。使用 SPE 前处 理技术，结合 Agilent 6495D UHPLC-MS/MS 系统进行方法开发和优化，建立了专属性 好、灵敏度高、稳定性好的 LC-MS/MS 方法，为核酸药物定量研究工作提供方法参考。
实验部分 试剂和样品 实验使用的乙腈和甲醇均为质谱级，购于 Merck。HFIP、TEA、 DIPEA、EDTA 等试剂均来自 Sigma Aldrich。实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水。对照品 siRNA 采用 No coding 序列定制合成，无生物学意义。生物样品基质使用 BioChemazone 模拟血浆替代以符合实验室生物安全要求。SPE 采用 Phenomenex Clarity® OTX 25 mg 96 孔固相萃取板。
仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效生物液相色谱系统，配备如下 安捷伦模块：二元泵（部件号 G7132A），自动进样器（部件号 G7137A），柱温箱（部件号 G7116B）。 色谱柱选用 Agilent PLRP-S, 1000 Å, 5 µm, 2.1 × 50 mm，带 PEEK 内衬（部件号 PL1912-1502PK）。 Agilent 6495D 三重四极杆质谱，配 MassHunter 12 质谱工作站。
液相色谱条件
系统： Agilent 1290 Infinity II 超高效生物液相系统，配置 multi-wash 多通道清洗进样器组件 流动相 A： 水 (0.2% HFIP, 0.1% DIPEA, 5 µM EDTA) 流动相 B： 甲醇 (0.2% HFIP, 0.1% DIPEA, 5 µM EDTA) 色谱柱： PLRP-S, 1000 Å, 5 µm, 2.1 × 50 mm，带 PEEK 内衬 流速： 0.2 mL/min 柱温： 80 °C 洗针液 1： 乙腈时间，30 s 洗针液 2： 水 (0.2% HFIP, 0.1% DIPEA, 5 μM EDTA)，时间 30 s
结果与讨论 质谱方法优化 OGN 药物分子量一般在 6000–9000 Da，在电喷雾 (ESI) 离子源 中呈多电荷分布的特点。OGN 形成一系列连续多电荷的 m/z 离 子并进入 MS 可检测的质量范围，同时也因为总离子信号分布在 多电荷离子上导致单个目标 m/z 的 MS 灵敏度降低。OGN 分子 中磷酸二酯骨架或者硫代磷酸酯骨架的存在使得它们在 MS 中容 易形成金属加合离子（如 +Na、+K 等），这些加合离子会让质谱 信号进一步变得复杂并降低单个目标 m/z 的灵敏度。因此，消除 金属加合离子的形成是提高 OGNs 药物 LC/MS 方法灵敏度的关 键因素之一。保持 LC 系统的清洁是减少金属加合离子的关键因 素，Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统以及带 PEEK 内衬的 PLRP-S 聚合物反相色谱柱能够极大降低金属加合离子的产生。 此外，流动相添加 1–5 µM EDTA 试剂能够螯合金属离子，降低 OGN 药物金属加合离子的产生。 选择丰度最高的目标 m/z 作为母离子并进行 CID 碎裂，有利于获 得尽可能高灵敏的 MRM 离子对方法。应尽可能避免选择 m/z 太 小的离子作为母离子，一方面是因为 MS 低质量端的干扰更多， 而高质量端的 m/z 离子选择性更好，开发的方法更加稳定；另一 方面，母离子 m/z 越小意味着电荷越多而在 CID 条件下容易碎裂 过多，也就越不容易获得丰度相对较高的碎片离子来优化 MRM 离子对。
液相色谱方法优化 siRNA 一般以双链的形式存在，当达到解链温度 (Tm) 60–70 °C 之间时，会链接成 AS 和 SS 两条链。实验中为了确保 siRNA 有 效解链，色谱柱温度设定为 80 °C，这样能够通过 SS 和 AS 链分 别定量的方式来测定 siRNA。 流动相中不同缓冲液的添加也会改变寡聚核苷酸的离子化效率， 进而影响 LC/MS 方法的灵敏度和定量下限。目前最为常见的流 动相添加剂是六氟异丙醇 (HFIP) 结合三乙胺 (TEA)、N-乙基二异 丙胺 (DIPEA)、三丁胺 (TBuA) 等不同的组合。在图 3 所示的方法 优化中，比较了 HFIP 和 TEA、HFIP 和 DIPEA 两种最为常见的组 合来测试方法灵敏度。通过对比 AS 和 SS 链各自的峰面积可以 看到，在使用 DIPEA 时获得更好的灵敏度，特别是疏水性较强的 SS 链灵敏度增加了超过 20 倍。这可能是因为该 siRNA 中的 SS 链存在疏水性修饰，而根据文献报道在 DIPEA 条件下疏水性 OGN 离子化效率更高。一般来讲，TEA 更加有利于亲水性的寡聚核苷 酸离子化效率，而 DIPEA 更加适合有疏水性集团修饰的 OGN 样 品[7]。在实际工作中，应该根据不同的 OGN 性质选择不同的缓冲 液组合及添加浓度进行了流动相优化和筛选。
谱柱残留在第二针开始已经低于 0.02%（在 1–1000 ng/mL 的动 态范围下对于残留的最低要求限量）。Agilent 1290 Infinity II 超高 效生物液相系统配置了 multi-wash 多通道清洗进样器组件，可以 同时选择最多三种不同的清洗液分别对进样针进行清洗，并同时 对针座进行反冲。这种设置大大降低了进样系统残留。经过优化 选择了两种洗针液（洗针液 1 乙腈；洗针液 2 含 0.2% HFIP, 0.1% DIPEA 和 5 μM EDTA 的水）分别清洗时间 30 s。通过优化色谱柱 和进样清洗流程，在最终的方法确认中完全满足《9012 生物样品 定量分析方法验证指导原则》中关于残留的限制要求。
线性、准确度和精度 使用最终优化的 LC/MS 方法条件对空白大鼠血浆样品中添加的 siRNA 样品进行部分方法学测试，使用大鼠空白血浆配制 0.2、 0.5、2、5、20、50、200、500 ng/mL 浓度工作曲线，同时配 制 1、10、100 ng/mL 三个浓度水平的 QC 样品，曲线及 QC 样 品均设置三个平行样品检验方法重现性。样品采用 Phenomenex Clarity® OTX 25mg 96 孔固相萃取板进行前处理，外标法进行定 量。图 5 分别展示了 SS 链的基质空白、LLOQ、ULOQ 及残留 的谱图。从图 5 可以看出，空白基质血浆中无干扰，方法专属 性好，特异性高；血浆中 LLOQ 可低至 0.2 ng/mL，仪器灵敏度 高；残留小于 20% LLOQ，满足定量性能要求。标准曲线及样品 分析数据见图 6。
结论 在使用 LC/MS 技术定量分析生物样品中 OGN 药物的时候，由于 药物本身所具有的亲水性强、高度负电性以及修饰类型多样等特 点，导致方法开发存在一定的难度。本方法采用 96 孔板 SPE 样 品前处理以及 Agilent 6495D LC-MS/MS 分析，可以检测血浆样 品中低至 0.2 ng/mL 含量的 siRNA 药物。 siRNA 的分析结果表明，相比于传统 C18 色谱柱，带 PEEK 内衬 的 PLRP-S 色谱柱能够显著降低 OGN 药物的色谱残留。1290 液相 系统配置的 multi-wash 功能也可以优化不同的系统清洗液组合， 进一步降低系统残留的风险。最终结果表明，在 0.2–500 ng/mL 的线性动态范围内，残留控制在 < 20% LLOQ 范围。 相对于小分子，OGN 药物的 MRM 方法优化更加复杂，不但要挑 选合适电荷的 m/z 母离子，还要避免金属加合离子带来的灵敏度 损失。本方法开发使用了 Agilent Optimizer 软件进行自动方法 开发，帮助我们用户更轻松的面对 OGN 药物的 LC/MS 方法开 发挑战。
