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技术文章
CHIP染色质免疫沉淀实验过程中的建议
点击次数：3470 发布时间：2022/2/14 14:14:34
染色质免疫沉淀 (ChIP) 是一种用于表观遗传学研究的技术，可以快速反映蛋白质-DNA 相互作用。 想要获得理想的结果，选择适合的抗体固然很关键，ChIP 流程中所有步骤也很重要。 该技术利用了多种分子生物学和蛋白质组学方法。
CHIP免疫沉淀实验原理：
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA的pian段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果。
CHIP免疫沉淀实验步骤
细胞固定
甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不wanquan，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
染色质断裂
交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。
通过五个步骤获得理想 ChIP 结果
CHIP免疫沉淀建议
使用的交联剂类型取决于需要观察的相互作用的类型
交联不充分，以及与甲醛过度交联，会增加背景信号并导致 DNA 丢失
过度交联会影响抗原的结合，掩盖表位，妨碍超声处理
在显微镜下比较样品后变化，检查细胞裂解的效率
不同类型的细胞有不同严格程度的裂解要求
如果在裂解中使用超声处理，应将染色质置于在冰上并将脉冲限制在 30 以内，以避免蛋白质因过热而变性。
原创作者：上海徕同生物科技有限公司
