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技术文章
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样
点击次数：2777 发布时间：2020/9/24 10:43:07
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控
制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影
响着光合速率。
测定原理：
在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO2结合，产生 2
分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢
酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的
变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、
冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：25mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 700uL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4
℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 700uL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4
℃保存一周；
粗酶液制备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL
提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前在试剂二中加入 22.5mL 试剂一，充分混匀，在 37℃（哺乳动
物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；现配现用；
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 6uL 样本、7uL 试剂三、7uL 试剂四和 180uL 工作
液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
Rubisco 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。
Rubisco 活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T =2680×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。
Rubisco 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总)
÷T=2680×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义：
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：比
色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.006 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，2 min；W：样本质量，g；
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。
Rubisco 活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T =5360×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。
Rubisco 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总)
÷T=5360×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义：
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：96
孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.006mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，2 min；W：样本质量，g；
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
