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技术文章
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase， TPI）试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2732 发布时间：2020/9/24 10:41:22
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase，
TPI）试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和
磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐
步转化为蔗糖。
测定原理
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与 NAD 在 3-磷酸甘油
醛脱氢酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH，340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异
构酶的活性的低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV
板）。
试剂组成和配制
提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解。
酶液提取
按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL
提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃，1000g 离心 5min，取上清在 4℃，4500g 离
心 20min，去上清，取沉淀加 0.5mL 提取液二，置于震荡仪上震荡 30s 溶解，置冰上 30min，
重复操作一次（或者震荡溶解后超声，超声条件为功率 200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间
1min），然后 4℃，12000g 离心 10min，取上清待测。
测定操作
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96 孔板（UV 板），依次加入 120μL 试剂一，20μL 试剂二，20μL 试
剂三，20μL 试剂四，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s
的吸光值 A2，△A=A2-A1
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min/g）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：比
色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min/g）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 321.54×ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：比
色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项
配置好的试剂二、试剂三、试剂四 3 天内使用完。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
