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技术文章
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样
点击次数：2894 发布时间：2020/9/24 10:24:02
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，催化草酰乙酸转化为磷
酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的关键酶。
测定原理：
PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次
催化 NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 18 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：液体×1 支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 支， -20℃保存；
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；现配现用；
3、试剂四的配制：临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；现配现用；
4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。
5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂四和 180μL 工作液，立即
混匀，记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意：在该试剂盒中，若 ΔA 大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA 小
于 0.1 可提检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
PEPCK 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）PEPCK 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷V 样÷T=3215×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）PEPCK 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷V 样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=6430×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK（nmol/min/104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=12.86×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
