降落PCR的循环数一般设置为多少?

降落 PCR 分为梯度降落循环和恒定温度扩增循环两段分开设置，分开说明：

一、梯度降落阶段（高温筛选）

标准区间：8～10 个循环

引物杂带多、简并引物、同源基因模板：10～12 轮，充分过滤非特异结合；

引物特异性好、几乎无杂带：6～8 轮，减少高温对 Taq 酶的损耗，提升产物量；

底线：不要少于 6 轮（失去降落 PCR 提升特异性的作用），不超过 12 轮（高温循环过多产物明显变弱）。

二、恒温扩增阶段（降温后固定温度扩增）

质粒、高拷贝模板：18～20 轮；

cDNA、基因组 DNA、微量低拷贝样本：22～28 轮；

上限不建议超过 30 轮，过多循环会积累引物二聚体与微弱杂带。

三、常用成套组合（可直接使用）

通用均衡方案（绝大多数实验）

降落 10 循环 + 恒温 20 循环，总扩增 30 轮

追求高纯度、杂带严重体系

降落 12 循环 + 恒温 20 循环，总扩增 32 轮

微量模板、需要提高产物亮度

降落 8 循环 + 恒温 24～28 循环，总扩增 32～36 轮

简单模板、特异性

降落 6 循环 + 恒温 18 循环，总扩增 24 轮

四、调整判断依据

条带干净但很淡：减少降落循环，增加恒温循环；

条带亮但杂带多：增加降落循环，恒温循环不变；

扩增片段＞2kb：降落循环控制在 8 轮以内，避免长时间高温导致酶活不足。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司