视网膜色素上皮层（RPE）在维持视网膜稳态和支持视网膜细胞（如感光细胞）方面起着关键作用。当 RPE 受损时，可能导致多种视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）。RPE 的损伤可由多种因素引起，如吸烟、暴露于紫外线和可见光。这些条件会产生活性氧（ROS），并诱导视网膜的氧化应激。线粒体功能障碍在 AMD 中起关键作用，研究表明，随着 AMD 进展，RPE 中的线粒体 DNA 损伤增加，进而导致细胞功能障碍和视网膜退化。

核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是一种关键的转录因子，调节细胞对氧化应激的防御能力。在 RPE 细胞中，Nrf2 的激活对防止氧化损伤尤为重要，氧化损伤是视网膜退行性疾病发病机制的重要因素。通过增强抗氧化反应，Nrf2 维持 RPE 细胞的功能完整性，从而在视觉功能中发挥保护作用。考虑到氧化应激在视网膜疾病中的核心作用，理解 RPE 细胞中 Nrf2 的调控可能为预防或治疗 AMD 等疾病的治疗策略提供宝贵见解。

鉴于 RPE 细胞对 AMD 氧化应激的易感性，针对氧化损伤和炎症的治疗方法至关重要。其中一种方法是使用色素上皮衍生因子（PEDF），该因子可在人体胎儿 RPE 细胞培养的条件培养基中鉴定。PEDF 可以保护神经元免受氧化应激和谷氨酸毒性的影响，在视网膜细胞中，它还能增加 AMD 患者抗氧化蛋白的表达。此外，PEDF 因其抗血管生成作用，可以抑制与 AMD 相关的脉络膜新生血管形成（CNV），证实了其治疗 AMD 的潜力。

以往研究已报告了胎盘来源的间充质干细胞（PD-MSCs）促进过氧化氢（H2O2）-诱导的大鼠视网膜中视网膜层的恢复。最近，韩国 CHA 大学生命科学系、生物医学系及医疗中心眼科团队在一项研究中旨在比较 PD-MSCs 与具有已知治疗潜力的 PEDF 因子的治疗效果，并探讨 PD-MSCs 是否能激活 H2O2-损伤的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）中的 Nrf2，从而发挥抗氧化作用。研究成果发表于Antioxidants 期刊题为“Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line”。

为了探索 PD-MSCs 对 ARPE-19 细胞中诱导的氧化应激的影响，将 ARPE-19 细胞用过氧化氢（H2O2）处理，并与初始 PD-MSCs 共培养。首先，分析了与 PD-MSCs 共培养的 ARPE-19 细胞中 PEDF 的 mRNA 表达。与对照组相比，H2O2 处理显著降低了 PEDF mRNA 水平，而与 PD-MSC 共培养则阻止了 H2O2诱导的降低（图1 A）。

RPE 细胞中的脂质代谢在维持与光感受器细胞的通讯中起着关键作用。然而，氧化应激可干扰脂质代谢，从而损害相关调控因子的正常功能。与脂蛋白相关的 ABCA1 和 ApoE 的 mRNA 表达在 H2O2 处理组中有所增加，但在 PD-MSC 共培养组中显著减少（图1 B、C）。脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平在 H2O2 处理组中上升，但在 PD-MSC 共培养组中显著减少（图1 D）。代表性图像显示出与 ABCA1 mRNA 表达相同的趋势（图1 E、F）。

为验证脂滴形成，通过 BODIPY 染色分析 ARPE-19 细胞，发现由 H2O2 处理增加的脂质形成在与 PD-MSC 共培养后显著减少（图1 G、H）。这些结果表明，PD-MSCs 抑制 H2O2 损伤的 ARPE-19 细胞中脂蛋白的形成。

图1 PD-MSCs共培养减少H2O2暴露的ARPE-19细胞中的脂质积累。

抗氧化作用对于在氧化应激环境中维持视网膜稳态至关重要。特别是，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化物氧化还原酶（Prx）是线粒体和过氧化物酶体中的关键抗氧化酶（图2 A）。接下来，为了分析 ARPE-19 细胞中的 mRNA 水平，培养并采集了下腔室的细胞，发现与 H2O2 处理组相比中，HO-1、SOD1、过氧化氢酶、GPx1 和 Prx3 的 mRNA 表达在 PD-MSC 共培养组中显著增加（图2 B-F）。HO-1、SOD1、过氧化氢酶和 Prx3 的蛋白质水平与 mRNA 表达呈相同趋势（图2 G）。

为确认 ARPE-19 细胞中内源性 SOD1 和过氧化氢酶水平，随后分析了 ARPE-19 细胞的培养上清液。这些参数在 H2O2 处理组降低，但在 PD-MSC 共培养组中显著增加（图2 H、I）。

为分析 PD-MSCs 是否影响线粒体氧化应激，使用 MitoSOX 染色检测 ARPE-19 细胞中的线粒体超氧化物 ROS 水平，发现线粒体 ROS 活性在 H2O2 处理组上升，但在 PD-MSC 共培养组中减少（图2 J、K）。这些结果表明，PD-MSCs 通过增强抗氧化作用来缓解氧化应激。

图2 PD-MSCs共培养通过增强暴露于H2O2的ARPE-19细胞中的抗氧化剂积累来减轻氧化应激。

线粒体动力学是线粒体循环的重要机制，包括“融合”和“分裂”。线粒体融合蛋白1/2（MFN1/2）和视神经萎缩蛋白1（OPA1）与线粒体融合相关。动力蛋白相关蛋白1（DRP1）和分裂蛋白1（FIS1）与线粒体分裂相关（图3 A）。FIS1 的 mRNA 表达在 H2O2 处理组中有所升高，但在 PD-MSC 共培养组中升高幅度更大（图3 B）。DRP1、MFN1/2 和 OPA1 的 mRNA 表达在 H2O2 处理组中减少，但在 PD-MSC 共培养组中显著增加（图3 C-F）。代表性图像显示出与 OPA1 mRNA 表达相同的趋势（图3 G、H）。

线粒体膜电位是线粒体能量储存和活性的关键指标。为分析 PD-MSCs 是否能增加线粒体膜电位，在 ARPE-19 细胞中进行了 JC-1 染色，发现H2O2 处理组中聚集体和单体 JC-1 的比例下降，但 PD-MSC 共培养组中显著增加（图3 I、J）。这些数据表明，PD-MSC 共培养通过调节 H2O2 暴露的 ARPE-19 细胞的线粒体动力学来增强线粒体膜电位。

RPE 与光感受器细胞之间的视觉循环对与维生素A 相关的视觉过程至关重要。暴露于氧化应激的 RPE 细胞会发生细胞凋亡，并表现出视觉循环的下调。为验证与 PD-MSCs 的共培养是否能调控这些变化，进行了 Caspase-3 和 RPE65 的免疫荧光染色。切割后 Caspase-3 的表达在 H2O2 处理组显著增加，但在 PD-MSC 共培养组减少。然而，RPE65 的表达则呈现相反趋势。RDH11 和 RPE65 的蛋白质水平在 H2O2 处理组中下降，但在 PD-MSC 共培养组中有所增加。这表明，PD-MSC 共培养改善暴露于 H2O2 的 ARPE-19 细胞的视觉循环。

图3 PD-MSCs共培养通过调节暴露于H2O2的ARPE-19线粒体动力学来增强线粒体膜电位。

，为分析抗氧化酶关键调控因子 Nrf2 的激活，在 mRNA 表达水平上评估了 PI3K/AKT 信号通路（Nrf2的上游调控通路）。此外，还调查了 PEDF 是否能激活这一机制。

PI3K p110α 的 mRNA 表达在 H2O2 处理组中减少，但在 PD-MSC 共培养组中显著增加。与 H2O2 处理组相比，单独 PEDF 处理显著提高了 PI3K p110α 的表达，但与 PD-MSC 共培养组相比差异并不显著。然而，PD-MSCs 与 PEDF 的联合处理显著提高了 PI3K p110α 的表达（图4 A）。单独使用 PEDF 处理并未显著增加 AKT 的表达，但是在仅与 PD-MSCs 共培养以及在 PD-MSCs 和 PEDf 联合培养的细胞中，其上调显著（图4 B）。Nrf2 的 mRNA 表达与 AKT 呈相同趋势（图4 C）。PI3K p110α、AKT 和 Nrf2 的蛋白质水平在 H2O2 处理组下降，但在 PD-MSC 共培养组中有所增加。此外，KEAP1 在 H2O2 处理组中表达升高，但当细胞与 PD-MSCs 共培养时，其水平趋于下降，而 Nrf2 表达则观察到相反的模式（图4 D-H）。

为确定 Nrf2 活化与其主要负调控因子 KEAP1 之间的相关性，进行了免疫染色。H2O2 处理后 Nrf2 表达略有增加，但统计学上无显著差异。随后，与 PD-MSCs 的共培养显著提升了 Nrf2 表达。以 KEAP1 为例，其表达在 H2O2 处理后没有显著变化，但与 PD-MSCs 共培养时表现出轻微下降。在 PD-MSC 共培养条件下，KEAP1 表达与 Nrf2 表达呈负相关（图4 I-L）。这些结果表明，PD-MSC 共培养激活暴露于 H2O2 的 ARPE-19 细胞中的 Nrf2 信号通路。

图4 PD-MSC共培养激活H2O2暴露的ARPE-19细胞中的Nrf2信号通路。

图5 PD-MSCs 通过Nrf2通路增加抗氧化酶对H2O2损伤的RPE的治疗作用概述。PD-MSCs通过PI3K/AKT信号通路激活Nrf2，促进抗氧化酶的表达。线粒体动力学受到调控，导致线粒体活性氧水平降低，线粒体膜电位稳定。RPE再生随着脂蛋白积累和细胞凋亡减少得到增强。

总之，该研究证明：H2O2 增加 ARPE-19 细胞中的线粒体 ROS 水平，导致线粒体功能障碍，还通过脂质过氧化和积累诱导细胞凋亡；PD-MSCs 激活 Nrf2，增加抗氧化剂表达，改善线粒体功能，减少脂质过氧化和积累，还可以通过 PI3K/AKT 信号通路调控 Nrf2。即 PD-MSCs 通过 Nrf2 介导的抗氧化机制来促进 H2O2 损伤的 ARPE-19 细胞的恢复。然而，PEDF 在这一过程中的直接作用仍不明确，需在各种实验条件下进一步研究。未来还需阐明 PEDF 调节视网膜修复的分子机制，并探索其与 PD-MSCs 的潜在协同效应。

参考文献：Hong SJ, Lee DH, Choi JW, Lee H, Sung Y, Kim GJ. Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line. Antioxidants (Basel). 2025 Oct 25;14(11):1279. doi: 10.3390/antiox14111279. PMID: 41300437; PMCID: PMC12649114.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41300437/或点击阅读原文