主动脉瓣疾病（AVD）是最常见的心脏瓣膜疾病。AVD 的病理生理复杂，涉及动脉高血压、剪切应力异常引起的主动脉瓣（AV）的机械性损伤，或内皮功能障碍及随后的脂质沉积和炎症反应。之后，各种分子通路被激活，最终通过人类瓣膜间质细胞（VICs）的成骨细胞分化或在 VICs 凋亡后细胞碎片上的弥漫性钙沉淀，导致瓣膜钙化。瓣膜上机械应力的增加被认为是启动该过程的关键。随着瓣膜钙化和 AVD 的进展，左心室（LV）压力的增强会进一步增加对主动脉瓣的机械压力，形成恶性循环。因此，精确理解主动脉瓣狭窄（AS）发病机制对于识别新的药物靶点至关重要。

鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）促进成骨细胞的增殖、分化和钙化。体内 S1P 浓度升高刺激了骨矿化。此外，机械刺激和剪切应激会增加骨细胞、内皮细胞和血小板中的 S1P 生成。然而，S1P 对体外和体内 VIC 生物学的影响，以及血浆和组织内 S1P 水平与 AVD 的关联，尚未被充分探讨。

基于此，德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学医学院心脏病学、肺病学和血管医学系、亚琛工业大学附属医院心脏外科团队在一项研究中探讨了 S1P 在 AS 病理生理中的作用，在小鼠和人类中提供了机制证据，表明 S1P 在 AVD 的病理生理和疾病进展中扮演重要角色，并已成功探索基于 S1P 受体靶向药物的 AVD 治疗方案。研究成果发表于Circulation期刊题为“Targeting Sphingosine-1-Phosphate Signaling to Prevent the Progression of Aortic Valve Disease”。

首先，为研究 S1P 高水平对丝线损伤 AVD 模型中 AVD 进展的影响，将C57Bl/6J小鼠在AV丝线损伤前一周开始使用S1P裂解酶抑制剂 DOP 以提高内源性 S1P 浓度。超声心动图和组织学显示，AVD 严重度增加且进展加快（图1 A-C）。通过超声心动图测量的 AV 面积和射血分数在 DOP 处理的动物中也有所减弱（图1 D、E）。心脏结构、超声心动图测定的左心室内径及左心室质量在该时间点无显著差异（图1 F、G）。然而，DOP 处理的 AVD 小鼠死亡率也显著更高（图1 H）。

为了分析12周内的疾病进展，测试了 S1P 低水平是否对 AS 进展有益。使用 SphK1 基因敲除小鼠（SphK1-/-），发现SphK1-/- 小鼠的 AVD 发展显著减轻，表现为整个12周超声心动图中峰值速度和平均压力梯度的降低（图1 I-K）。DOP 处理显著加重 SphK1-/- 小鼠的AVD发展和严重程度，表现为更高的峰值梯度和平均压力梯度（图1 J、K）及更小的 AV 面积（图1 L）。这对心脏功能和结构有明显影响：SphK1-/- 小鼠在12周后射血分数较高（图1 M）、左心室内径较小（图1 N）、舒张末期容积较低（图1 O）、左心室质量减少（图1 P），而DOP处理则损害心脏功能（图1 M-P）。AVD 诱导12周后心脏基因表达分析显示，SphK1-/- 小鼠心衰基因 BNP 和 ANP 表达降低，DOP 表达增加（图1 Q、R）。

12周后，SphK1-/- 小鼠 AVs 内钙化减少，DOP 处理的 SphK1-/- 小鼠钙化增强（图1 S）。循环钙化标志物分析显示，与对照组相比，SphK1-/- 小鼠的 RANKL 血浆水平升高，且 DOP 抑制（图1 T），而 DOP 处理的 SphK1-/- 小鼠 OPG 水平升高（图1 U），RANKL/OPG 比值较对照组下降，DOP 处理后再次升高（图1 V）。RANKL/OPG 比值与峰值速度作为 AS 严重程度的衡量指标呈明显负相关（图1 W）。这些数据表明，在小鼠 AS 模型中，S1P 水平决定 AVD 进展及其对心脏功能的影响。

图1 S1P水平决定了AVD进展及其对小鼠AVD模型心脏功能的影响。

由于 S1P/S1PR2 信号传导已被证明能激活成骨细胞，并且 S1PR2 在 AVs 中表达，因此随后研究了 S1PR2-/- 小鼠 AVD 的发展。S1PR2-/- 的最大流速和平均压力梯度分别显著降低，AV 面积显著增大（图2 A-C）。因此，在12周后 S1PR2-/- 表现出更好的心脏功能和更小的左心室内径（图2 D-F）。BNP 和 ANP 基因表达也有所减弱（图2 G、H）。值得注意的是，S1PR2-/- 小鼠的 DOP 处理未能加重 AVD 进展（图2 I、J）。这表明，缺失 S1PR2 的小鼠对 AVD 进展具有抵抗力。

为探讨 S1PR2 是否可作为 AVD 的治疗靶向，诱导 AS 后不久（6小时）给药 S1PR2 拮抗剂 JTE-013。JTE-013 处理完全阻止了对照组在两周内观察到的流速和平均梯度的增加（图2 K、L），表明对 AVD 进展具有保护作用。这种保护即使在 JTE-013 停药两周后依然有效：尽管流速和平均压力梯度在接下来的几周内有所恶化，但直到12周后才追上了对照组的水平。尽管如此，4周时观察到的 JTE-013 治疗的积极效果在12周后基本保持不变（图2 K-M）。尽管流速增加（图2 M）及类似的 AV 面积（图2 N），但 JTE-013 处理小鼠在4周及12周后射血分数仍优于对照组。初次 JTE-013 处理还抑制了 LV 内径增大至少12周（图2 O）。这些数据表明，药理学上的 S1PR2 拮抗剂可防止 AVD 进展。

图2 S1P依赖的AVD进展通过S1P受体2介导。

为进一步研究相关机制，对从健康人体瓣膜分离的VIC暴露于易钙化条件下10天，观察到S1P 刺激强烈增强了 VIC 钙化（图3 A）。与 JTE-013 的联合处理可防止 S1P 依赖性的 VIC 钙化，而 S1PR1 抑制剂 W146 和 S1PR3 抑制剂 TY-52156 分别无效（图3 A）。S1P 还增加了 RUNX2 的基因表达，但未增加蛋白质表达，RUNX2 是钙化和成骨的重要刺激因子，但该效应被 JTE-013（图3 B、C）削弱。然而，OPG（RUNX2的重要成骨基因和转录靶点）由 S1P 在基因和蛋白质层面诱导，JTE-013 则逆转了这一过程（图3 F、G）。JTE-013 还抑制了 GSK3β 的磷酸化（图3 H），作为 RUNX2/OPG 诱导的典型 GSK3β-Wnt-β-catenin 信号的读数。“晚期”成骨标志物（SP7）的表达保持不变（图3 D、G）。这些数据表明，S1P 通过 S1PR2 和成骨 RUNX/OPG 信号诱导 VIC 钙化。

图3 S1P通过S1PR2和成骨RUNX/OPG信号诱导VIC钙化。

，通过转化方法，利用液相色谱-质谱法测量了从接受心脏移植患者中取出的健康人类 AVs 组织提取物中的 S1P 浓度，并将手术置换后获得的狭窄性 AVs 中的 S1P 进行了比较。结果发现，狭窄瓣膜的 S1P 浓度高出对照组的2.7倍（图4 A）。狭窄瓣膜中SphK1基因表达也被诱导为2.9倍（图4 B），而 S1PR2 的表达未发生改变（图4 C）。同时，AVD 患者（图4 D）以及 AVD 诱导后的小鼠 S1P 血浆水平未升高。AVD患者的高密度脂蛋白胆固醇水平也无差异。

研究人员假设狭窄瓣膜中较高的生物力学拉伸可能导致 S1P 升高。首先，确认流速的增加反映在轴向和周边壁剪应力的增加上（图4 E-G）。为模拟体外实验，以每分钟 60 次拉伸频率，使 VICs 以 10%，1 Hz 的机械拉伸幅度持续24小时，观察到 SphK1 基因上调1.6倍，但蛋白质表达无变化（图4 H），且 S1PR2 无变化（图4 I）。然而，拉伸明显增加了 S1P 的生成（2-3倍）（图4 K、L）。此外，已确认 SphK1 是主因，因为在 SphK1 特异性抑制剂 PF-543 存在下，C17-S1P 的产生被完全消除（图4 K、L）。这些数据表明，S1P 在人体狭窄瓣膜中增加，其产生由 VICs 中的生物力学拉伸激活。

图4 S1P/SphK1模块在体内高壁剪切下人体狭窄瓣膜中增加，并在体外通过VICs中的生物力学拉伸激活。

图5 图形概要

这项研究发现 S1P/S1PR2 信号在 AVD 进展中的新作用。主要发现如下：（1）药物学上 S1P 升高加剧 AVD 进展和心脏功能恶化，而基因表达上 S1P 下调或 S1PR2 缺失则减轻了两者；（2） S1P/S1PR2 信号通过 RUNX2/OPG 和 GSK3β-Wnt-β-catenin 通路诱导 VICs 的成骨细胞分化;（3）人类狭窄瓣膜的 S1P 含量和 SphK1 表达较高，而生物力学拉伸激活了 VICs 中 SphK1 依赖性的 S1P 生成；（4）在小鼠诱导 AS 后启动的药理学 S1PR2 抑制成功防止了 AS 的发生及其对心脏的有害后果（图5）。

总而言之，全身或局部 S1P 水平升高会导致瓣膜钙化加剧。S1PR2 拮抗剂和 SphK1 抑制剂可能在预防、改善疾病或预防方面为人类 AVD 提供可行的药理学方法。

参考文献：Benkhoff M, Barcik M, Mourikis P, Dahlmanns J, Kahmann P, Wollnitzke P, Hering M, Huckenbeck T, Hoppe J, Semleit N, Deister-Jonas J, Zako S, Seel J, Coman C, Barth M, Cramer M, Helten C, Wildeis L, Hu H, Al-Kassis G, Metzen D, Hesse J, Weber J, Dannenberg L, Akhyari P, Lichtenberg A, Quast C, Gerdes N, Zeus T, Borst O, Kelm M, Petzold T, Ahrends R, Levkau B, Polzin A. Targeting Sphingosine-1-Phosphate Signaling to Prevent the Progression of Aortic Valve Disease. Circulation. 2025 Jan 28;151(4):333-347. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.067270. Epub 2024 Oct 21. PMID: 39429140.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39429140/或点击下方阅读原文