系统性硬化症（SSc）患者通常表现为皮肤纤维化，也可延伸至内脏器官。纤维化是由于细胞外基质（ECM）蛋白（如纤连蛋白和胶原蛋白）的过度沉积，主要由活化的成纤维细胞产生，导致组织结构破坏、器官功能障碍及器官衰竭。浆细胞样树突状细胞（pDCs）是先天免疫细胞，专门产生大量 I 型干扰素（IFN），这与 SSc 有关。事实上，pDCs 在 SSc 患者的受累组织中积累，研究表明，小鼠模型中 pDCs 的消耗可改善纤维化。此外，激活的 pDCs 通过持续产生 IFN-α 导致 SSc 中 I 型 IFN 水平的升高。

不同的生理条件，特别是当对蛋白质合成和折叠有很高的需求时，可能会促进内质网（ER）应激。在未折叠和错误折叠的蛋白质积累后，免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）与 ER 应激传感器——蛋白激酶R 样ER 激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和激活转录因子6（ATF6）——解离，未折叠蛋白反应（UPR）被启动以支持 ER 稳态。枯草杆菌酶细胞毒素 SubAB 是一种由产志贺毒素大肠杆菌（STEC）菌株产生的 AB5 毒素，通过裂解 BiP 诱导 ER 应激。用药物诱导剂促进人肺成纤维细胞的 ER 应激可上调胶原蛋白和成纤维细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的产生。

据报道，ER 应激标志物在 SSc 中上调，重要的是，在 SSc 患者分离的循环 pDCs 中观察到 ER 应激信号通路失调。尽管最近的研究将 pDCs、ER 应激和 SSc 联系起来，但它们在纤维化中作用的确切机制仍不清楚。鉴于 pDCs 和成纤维细胞可能在受影响的组织中相互作用，因此，葡萄牙阿威罗大学生物医学研究所及澳大利亚阿德莱德大学分子与生物医学系研究团队探讨了 ER 应激对 pDCs 和成纤维细胞共培养的影响。研究成果发表于 Cell Communication and Signaling 期刊题为“Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation”。

首先，为了研究 pDCs 对成纤维细胞行为的影响，建立了 CAL-1 细胞、pDC 细胞系和 IMR-90 肺成纤维细胞的体外共培养模型，观察到 CAL-1 细胞与成纤维细胞形成偶联物，经过几个洗涤步骤后不易脱落（图1 A ）。当比较共培养物与单独培养的 IMR-90 和 CAL-1 细胞组合的对照中不同 ECM 成分的量时，观察到 α-SMA 的蛋白质和 mRNA 水平均降低，I 型胶原 mRNA 水平也有所降低，这可能是由于共培养中 CAL-1 和 IMR-90 细胞之间的生长速率存在差异，从而可能会影响细胞：细胞比例，同时降低产生 α-SMA 的细胞比例。

为了测试 pDC 激活是否会影响成纤维细胞活化，将 IMR-90-CAL-1 与 Toll 样受体7（TLR7）激动剂 CL307 共培养，其促进 CAL-1 细胞分泌 IFN-β，结果观察到，IMR-90 细胞单一培养和 IMR-90-CAL-1 细胞共培养在用 CL307 处理后均未表现出纤连蛋白或 α-SMA 表达的改变（图1 B）。

为了测试 ER 应激对共培养物的影响，用 SubAB 处理细胞。正如预期，SubAB 处理在单独培养的 IMR90 细胞和 IMR-90-CAL-1 细胞共培养中诱导了 UPR 激活，GADD34 水平升高证实了这一点。GADD34 在激活的 ER 应激传感器 PERK 的下游产生，并作为负反馈蛋白，以减弱 UPR 信号传导。SubAB 处理单独培养的 IMR-90 成纤维细胞导致纤连蛋白水平增加，而不影响 α-SMA，并降低 I 型胶原 mRNA 水平。单独培养的 CAL-1 细胞不表达纤连蛋白、α-SMA 和 I 型胶原蛋白。然而，最重要的是，将 SubAB 添加到 IMR-90-CAL-1 共培养物中促进了纤连蛋白和 α-SMA 在蛋白质和 mRNA 水平上的产生。

因此，SubAB 诱导的 ER 应激与 CAL-1 细胞的存在相结合，促进纤连蛋白的产生和成纤维细胞活化，这是纤维化的两个标志。

图1 IMR-90 和 CAL-1 细胞在共培养中相互作用。

接下来，还测试了其他 ER 应激诱导剂的作用，即抑制蛋白质糖基化的衣霉素（Tm）和 BiP 抑制剂 HA15。出乎意料的是，Tm 处理在共培养和 IMR-90 单一培养中分别诱导了纤连蛋白和 α-SMA 蛋白水平的降低（图2 A）。通过分析 Tm 处理 6 小时后 PERK 和 eIF2α 的磷酸化以及 GAD34 的上调证实了 IMR-90 和 CAL-1 细胞中的 ER 应激诱导。另一方面，HA15 以更像 SubAB 的方式影响直接共培养，上调纤连蛋白和 α-SMA 蛋白水平（图2 B）。然而，HA15 并未促进纤连蛋白在单一培养的 IMR-90 细胞中的积累，尽管 GADD34 在孵育3 天后上调（图2 B）。

之前已经观察到，pDC 暴露于 SubAB 会触发 PERK 和 IFN 基因刺激因子（STING）的激活，这是诱导 pDC 激活的关键。因此，为了阐明 CAL-1 细胞 PERK 和 STING 表达的作用，直接将 IMR-90 与 Sting1−/− 或 Perk/EIF2AK3−/− CAL-1 细胞共培养（图2 C ）。虽然 STING 的缺失不会影响纤连蛋白的表达，但 PERK 的缺失消除了 SubAB 处理的共培养物中纤连蛋白和 α-SMA 表达的上调（图2 C）。

这些结果表明，在 CAL-1 细胞中，BiP 抑制/降解和随之而来的 UPR 诱导，特别是 PERK 通路，促进了 CAL-1 和 IMR-90 细胞共培养物中纤连蛋白和 α-SMA 的产生。

图2 BiP 抑制/耗竭和 PERK 激活影响 IMR-90-CAL-1 共培养物中纤连蛋白和 α-SMA 的表达。

TGF-β1 是一种众所周知的促纤维化因子，通过与 TGF-β 受体2 结合直接激活成纤维细胞，诱导 ECM 的产生，还可以调节免疫细胞功能。为了阐明 SubAB 诱导的作用是否伴随着 TGF-β1 上调，分析了其在细胞培养基中的 mRNA 表达和蛋白质水平，发现 SubAB 没有诱导 TGF-β1 表达，但其分泌水平降低，这可能是由于 PERK 激活下游的蛋白质合成抑制（图3 B）。因此，SubAB 处理的共培养物中的成纤维细胞活化不受 TGF-β1 驱动。

为了测试成纤维细胞活化是否可以由细胞分泌的其他因子介导，将 IMR-90 成纤维细胞与来自 CAL-1 或 IMR-90-CAL-1 共培养物的 CM 一起孵育（图3 B）。结果观察到，与各自的对照相比，用 SubAB 处理的来自 CAL-1 单独培养或直接共培养物的 CM 都不会促进 IMR-90 细胞中纤连蛋白或 α-SMA 的产生增加（图3 C、D）。此外，在存在或不存在 SubAB 的情况下，将 IMR-90 成纤维细胞在下室中共培养，CAL-1 细胞或 IMR-90-CAL-1 共培养物置于上室（图3 E），发现这两种条件都没有导致 IMR-90 α-SMA 的产生增加（图3 F、G）。在 SubAB 条件下观察到纤连蛋白水平略有增加，这更可能是由于添加到培养物中的 SubAB 的影响，GADD34 的存在证实了这一点（图3 C、F）。这些结果表明，SubAB 处理的 CAL-1 细胞分泌的可溶性因子，无论是在单一培养中还是与 IMR-90 成纤维细胞接触共培养中，都不足以促进成纤维细胞活化。

这些发现表明，ER 应激导致 CAL-1 以细胞间接触依赖性方式促进 IMR-90 成纤维细胞的激活。

图3 在 SubAB 诱导的 ER 应激期间，CAL-1 诱导的 IMR-90 激活依赖于细胞间接触。

总体而言，该研究发现，ER 应激激活的 CAL-1 细胞可以通过直接接触成纤维细胞（纤维化的核心关键参与者之一）触发 ECM 产生和 IMR-90 成纤维细胞活化。因此，这项工作揭示了 pDCs 可能导致纤维化的机制，这有助于理解纤维化过程，并为纤维化疾病的创新方法的开发开辟新的前景，特别是对于 SSc。

参考文献：Ferreira BH, Silva IS, Mendes A, Leite-Pinheiro F, Paton AW, Paton JC, Duarte IF, Pierre P, Almeida CR. Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation. Cell Commun Signal. 2025 Feb 7;23(1):66. doi: 10.1186/s12964-025-02057-7. PMID: 39920698; PMCID: PMC11804055.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39920698/

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