过度机械负荷被认为是研究骨关节炎生理特征的良好模型，为了鉴定机械负荷后对软骨细胞的重要基因，施加 5%、10% 或20% 的 0.5 Hz 循环拉伸应力24小时，并进行 RNA 测序分析。差异表达分析揭示了459个差异表达的基因。与正常软骨细胞相比，过度机械负荷（20%）处理的软骨细胞中 RPL35 基因表达表现出最明显的下调。进一步验证 RPL35 与过度机械负荷处理的软骨细胞之间的关联，发现过度机械应力不仅促进了分解代谢效应，而且刺激了软骨细胞衰老。

番红O染色显示，在 13.5 N 的峰值压缩负荷下持续多次刺激 2 或 4 周可诱导小鼠膝关节蛋白多糖的丢失。然而，在 4 N 和 9 N 的刺激下，软骨细胞没有显著变化（图1 F、G）。IHC 软骨染色同样证实，在施加 13.5 N 的过大机械压缩后，软骨细胞 RPL35 蛋白水平显著下降（图1 F-K）。这些发现揭示了 RPL35 蛋白水平随着 OA 的进展而降低，表明 OA 严重程度与 RPL35 表达之间存在关联。

图1 软骨细胞RPL35水平因机械超负荷而降低，OA关节软骨的RPL35水平下降。

接下来，通过敲低 RPL35 以探索其在 OA 进展中的作用，评估了 RPL35 的缺失是否驱动原代小鼠软骨细胞的退变。结果显示，RPL35 敲低降低了 Col2 水平，增加了 MMP13、P16 和 P21 的水平。此外，还通过关节注射研究了 RPL35 在体内的作用，观察到体内敲低 RPL35 后软骨细胞中 RPL35 的表达显著降低，且这种降低伴随着软骨的退行性变化。在关节软骨承受过大机械应力的小鼠中也观察到了类似现象，但并未观察到其敲低加剧了骨关节炎的进展。

图2 RPL35在软骨细胞中的过表达可防止机械诱导的软骨细胞衰老和OA发展。

研究人员试图确定哪种信号通路负责 RPL35 敲低后诱导软骨细胞衰老。因此，鉴定了 4989 个转录本，发现上调的转录本大部分在 Hedgehog（Hh）通路中富集。qPCR结果显示，敲低 RPL35 或过度机械负荷导致软骨细胞 GLI-1 和SMO表达增加，它们是 Hh 通路激活的标志物。IHC 和 IF 均表明，在过度机械负荷下软骨中 SMO、Gli-1 和 PTCH1 Hh 信号增加，而添加 RPL35 恢复了 SMO、Gli-1 和 PTCH1 的表达。这些结果说明了 RPL35 对 Hh 通路的抑制作用。

通路分析显示，与正常软骨细胞相比，用 RPL35 siRNA 处理的原代软骨细胞中，有17个上调的转录本介导 Hh 信号通路，其中酪蛋白激酶1ε（CK1ε）是最突出的（图3 A、B）。qPCR和WB分析显示，软骨细胞中 RPL35 的敲低提高了内源性CK1ε 水平（图3 C）。此外，在过度机械负荷处理的软骨细胞中也观察到 CK1ε 水平升高，而添加 RPL35 恢复了 CK1ε 的表达（图3 D）。IF染色分析也观察到相同的趋势（图3 E）。

因此，探讨了 CK1ε 在 OA 发展中的作用。与正常软骨细胞相比，CK1ε 过表达的软骨细胞 MMP13 水平升高、Col2 水平降低以及衰老相关标志物 P16 和 P21 水平升高，而敲低 CK1ε 则具有保护作用（图3 F）。此外，还探索了 siRPL35 是否通过靶向 CK1ε/SMO 信号来调控 OA 过程，WB结果表明，RPL35 敲低的影响被 CK1ε 敲低显著减弱（图3 G）。此外，RPL35 敲低后 CK1ε 水平升高，并与 SMO 共定位增加（图3 H），进一步提示了 CK1ε 激活 SMO 的可能性。总之，这些数据表明，抑制 RPL35 可导致 OA，可能是通过提高 CK1ε 蛋白水平，从而与 SMO接触激活，最终激活 Hh 通路。

图3 RPL35 通过 Csnk1e（CK1ε）调节 Hh 信号转导活性。

图4 图形概要

综上所述，该研究明确了 RPL35 和 CK1ε 在 OA 中的作用和联系，实验结果验证了 CK1ε 在关节软骨中的过表达激活了 Hh 通路，表明 RPL35 的缺失和 CK1ε-Hh 信号通路的激活在生物力学诱导的软骨细胞衰老和退变中起着关键作用。因此，靶向关节内补充 RPL35 是减缓 OA 发展的一种方式。

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。如有任何的想法以及建议，欢迎联系小编。感谢各位的浏览以及关注！进入官网www.naturethink.com或关注“Naturethink”公众号，了解更多相关内容。

原创作者：上海泉众机电科技有限公司