低剪切应力通过 Piezo1 介导的机械感觉诱导中性粒细胞胞外陷阱的产生，从而加剧动脉粥样硬化-专业论文-技术文章-上海泉众机电科技有限公司

低剪切应力通过 Piezo1 介导的机械感觉诱导中性粒细胞胞外陷阱的产生，从而加剧动脉粥样硬化

发布时间：2024/10/14 8:40:49关注度：2777

动脉粥样硬化是心血管疾病最常见的病理基础。最近的证据支持，中性粒细胞（Neutrophils）是最丰富的先天免疫哨兵，在动脉粥样硬化中起着重要作用，其中一种可能的机制与 NETosis 有关。NETosis 是中性粒细胞的炎性细胞死亡方式，在这个过程中，活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs），这是由解聚的染色质和蛋白质颗粒组成的纤维状结构。研究发现，注射脂多糖（LPS）的 ApoE−/− 小鼠随着髓细胞和 NETs 的积累而产生更大的病变面积。介导组蛋白瓜氨酸化的肽酰基精氨酸脱亚胺酶-4（PAD4）在 NETs 的形成过程中起着至关重要的作用。研究报道，与稳定斑块患者相比，不稳定斑块患者的 PAD4 水平升高。然而，动脉粥样硬化中 NETosis 的触发因素仍在研究中。

研究表明，中性粒细胞的形态和活性与血流剪切应力有关。然而，LSS 是否能直接触发 NETosis，目前还不得而知。机械活化的 Piezo1 是一种新发现的离子通道，Piezo1 介导离子，尤其是 Ca2+ 流动，将机械力信号转换为电化学信号。最近的一项研究强调，Piezo1 通过上调组蛋白去乙酰基酶2（HDAC2）来抑制视网膜母细胞瘤基因 Rb1。细胞内 Ca2+ 含量增加，HDAC2 通过激活 PAD4 促进 NET 形成。

最近，在重庆大学医学院智慧检验与分子医学中心、重庆大坪医院心血管外科及重庆大学生物工程学院科研团队的一项研究中，利用平行板流室评估了 LSS 在体内 NET 生成和动脉粥样硬化病变发展中的作用，并探讨了 LSS 促进 NET 生成并损伤中性粒细胞样 HL-60（dHL-60）细胞和骨髓来源的中性粒细胞（BMNs）的潜在机制。结果表明，LSS 相关 NET 的形成通过 Piezo1-HDAC2 轴促进动脉粥样硬化，这可能成为未来有前途的治疗靶点。研究成果发表在 Atherosclerosis 期刊题为“Low shear stress exacerbates atherosclerosis by inducing the generation of neutrophil extracellular traps via Piezo1-mediated mechanosensation”。

首先，为了探讨 LSS 对 NETs 和动脉粥样硬化病变产生的影响，建立了喂食 HFD 的动脉粥样硬化小鼠模型，4周后，HFD 组的中性粒细胞的比例均显著增加。为了评估 LSS 对体内中性粒细胞的影响，在左颈动脉（LCA）中生成了部分结扎模型（图1 A）。在 HFD 小鼠中，部分 LCA 结扎在颈动脉中诱导了晚期动脉粥样硬化病变，并伴有大量的脂质沉积，但在 LCA 的脂质病变中发现的 NETs 比在 RCA 中发现的更多，表明 LSS 对 NET 的产生有影响。此外，随着时间的延长，颈动脉中 NETs 的积累显著增加（图1 B）。这说明，低剪切应力在空间上与 NETs 和动脉粥样硬化相关。

为了证明 NET 形成与动脉粥样硬化斑块形成之间的直接关系，对 ApoE−/− 小鼠喂食 HFD 并每天腹膜内注射 GSK484 以抑制 NET 的形成。腹主动脉的表面染色显示，GSK484 组血管上的脂质沉积少于对照组，特别是在血管分叉处。H&E和油红O染色结果均显示，GSK484 组动脉粥样硬化斑块的进展较少。这说明，抑制 NETosis 可减少斑块形成。

图1 LSS在体内促进中性粒细胞胞外陷阱（NET）的产生。

接下来，实验利用平行板流室研究了 dHL-60 细胞对不同剪切应力的响应（图2 C），分别暴露于 LSS（5 dyne/cm²）、PSS（12 dyne/cm²）和 0 dyne/cm²下，发现LSS 组 NETs 相关蛋白瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3+）细胞显著增加，Western blot 分析进一步证实这一结果（图2 D、E）。在 BMNs 中验证这些发现，免疫荧光染色和蛋白质印迹分析均显示 LSS 组中 CitH3 表达较高。这些结果表明，LSS 可以直接诱导 NETs 的形成。

为了进一步验证剪切应力诱导的 dHL-60 细胞对 HUVECs 的影响，将不同的剪切应力诱导的 dHL-60 细胞与 HUVEC 共培养，发现 LSS 诱导的 dHL-60 细胞更容易粘附在 HUVECs 上，并导致更多的 HUVECs 细胞死亡。通过流式细胞术进一步发现，LSS 诱导的 dHL-60 细胞加剧了 HUVECs 的细胞凋亡。接下来，我们比较了不同组中细胞凋亡调节因子 Bcl-2 和 Bax 的蛋白表达，发现 LSS 诱导的 dHL-60 细胞下调 HUVECs 中 Bcl-2 表达并上调 Bax 表达。这些发现表明，LSS 诱导的 dHL-60 细胞在体外调节 HUVECs 细胞凋亡方面具有作用。

为了更好地观察剪切应力对中性粒细胞和内皮细胞之间相互作用的影响，将 HUVECs 预先固定在平行板流室中，再将 dHL-60 细胞悬浮液加入。结果观察到，与 PSS 和静态组相比，LSS 组中中性粒细胞和内皮细胞之间的粘附显著增加。同时，免疫荧光染色结果显示，LSS 组流动细胞的凋亡率低于对照组。这些数据表明，体外 LSS 促进 NET 形成，加重内皮细胞凋亡。

然后，为了阐明剪切应力下中性粒细胞传感的具体机制，比较了 LSS、PSS 和静态条件下 BMNs 和 dHL-60 细胞中 Piezo1 的表达水平。与 PSS 和静态条件下相比，LSS 下的 BMNs 中 Piezo1 的蛋白表达显著降低，同时，LSS 下 dHL-60 细胞中 Piezo1 的 mRNA 表达显著降低（图2 A）。LSS 诱导的 dHL-60 细胞表现出低 Piezo1 和高 HDAC2 表达，而 PSS 诱导的 dHL-60 细胞表现出高 Piezo1 和低 HDAC2 表达，这表明 Piezo1 和 HDAC2 表达之间存在潜在关系（图2 B-C）。此外，与 PSS 组和静态组相比，LSS 组 dHL-60 细胞内 Ca2+ 浓度明显降低（图2 D），但 ROS 浓度有所增加（图2 E）。这些结果表明，LSS 可以通过 Piezo1-HDAC2 轴直接促进 NET 的产生。

图2 Piezo1和HDAC2参与dHL-60细胞的剪切应力响应。

为了研究 LSS 对 dHL-60 细胞中 NET 形成的促进作用是否由 Piezo1 介导，实验敲低了 Piezo1。免疫印迹表明，CitH3 水平显著升高，CitH3+ 细胞数量显著增加。此外，在蛋白质和 mRNA 水平上都发现 HDAC2 显著升高，且，Piezo1 的敲低也抑制了细胞内 Ca2+ 的内流并导致 ROS 水平升高。这说明，敲低 Piezo1 促进 dHL-60 细胞内 NET 的形成。进一步地，将 Piezo1 的激动剂 Yoda1 添加到 LSS 刺激或非 LSS 刺激的 dHL-60 细胞中，发现Yoda1 显著逆转 LSS 诱导的 NET 形成。同时，LHDAC2 蛋白水平也减少。此外，用 Yoda1 处理增加了细胞中的钙内流并降低了 ROS 水平。这些结果进一步表明，Piezo1 在中性粒细胞的机械负荷传感中起着至关重要的作用。

为了进一步验证 Piezo1、HDAC2 和 NET 形成之间的关系，将 5 mM VPA（HDAC2 抑制剂）或 5 μM Theophylline（HDAC2 的激动剂）加入 dHL-60 细胞。单独使用 VPA 对 dHL-60 细胞中的 NETosis 没有影响，对 LSS 或 Piezo1 敲低诱导的 NETosis 影响不大（图3 A、B）。VPA 对 Piezo1 表达影响不大（图3 A、C），表明 Piezo1 可能是 HDAC2 的上游调节因子。然而，VPA 增加了细胞内 Ca2+ 的浓度，但在 LSS 或 Piezo1 敲低处理下降低（图3 D）。VPA 抑制了 ROS 的产生（图3 E），表明 HDAC2 可能通过 ROS 促进了 NETosis。

在静态培养的 dHL-60 细胞中，Theophylline可以强烈诱导 NETs 的形成，但 Yoda1 处理减弱了其对 NETosis 的促进作用。升高的 HDAC2 对 Piezo1 的表达没有显著影响，但明显降低了细胞内 Ca2+ 的浓度。这表明 Piezo1 确实是 HDAC2 的上游调节因子，并且 Ca2+ 和 HDAC2 之间可能存在相互作用。在 Theophylline 刺激下，ROS 水平显著增加，但 Yoda1 也可以降低 ROS 水平。这表明，ROS 是 HDAC2 的效应子，是诱导 NET 形成的关键分子。这些数据表明，LSS 通过 Piezo1 触发 NET 的形成，Piezo1 下调细胞内 Ca2+ 水平，上调 HDAC2 表达并促进 ROS 生成。

图3 抑制HDAC2通过影响细胞内Ca2+和ROS促进NETosis，但对piezo1表达影响不大。

图4 图形概要

总之，该研究表明，LSS 诱导的 NET 形成可能在动脉粥样硬化的发展中起关键作用。在动物实验中，抑制 NET 显著减少了斑块的形成并阻碍了动脉粥样硬化的进展。在细胞实验中，LSS 通过下调 Piezo1 表达使细胞内 Ca2+ 浓度失衡并增加 HDAC2 表达，来促进 NETosis。HDAC2 增加组蛋白3 的去乙酰化，从而增加 PAD4 的活性和组蛋白3 的瓜氨酸化，这对 NETosis 很重要。此外，细胞内 ROS 水平受 LSS 和 HDAC2 表达的调控，这促进了 ROS-依赖性 NETosis。这一有趣的新概念可能会揭示斑块侵蚀的新机制，并可能促进动脉粥样硬化疾病（尤其是血管分叉病变）新疗法的开发。它还有助于进一步了解 NETosis 和 NETosis 相关炎症的机制。

参考文献：Zhu Y, Wang T, Yang Y, Wang Z, Chen X, Wang L, Niu R, Sun Z, Zhang C, Luo Y, Hu Y, Gu W. Low shear stress exacerbates atherosclerosis by inducing the generation of neutrophil extracellular traps via Piezo1-mediated mechanosensation. Atherosclerosis. 2024 Feb 10;391:117473. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2024.117473. Epub ahead of print. PMID: 38412763.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38412763/

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原创作者：上海泉众机电科技有限公司

关键字：Naturethink, 剪切应力, 细胞剪切力与压力

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