Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1

KWS：Piezo1；M2 macrophage；mechanotransduction；bone formation；TGF-β1

骨骼是一种动态组织，通过两个密切联系的过程维持生长和重塑：骨吸收（bone resorption）和骨形成（bone formation）。免疫细胞在骨重塑过程中处于压力和负荷之下，它们在免疫中的作用尚未得到充分分析。巨噬细胞是多用途的免疫系统细胞，对代谢控制、病原体防御和组织修复至关重要。M1巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL-6）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），M2巨噬细胞产生精氨酸酶-1（Arg-1）、白细胞介素-10（IL-10）、重组甘露糖受体C型（MRC1）、CD206和TGF-β，对骨重塑过程至关重要。

Piezo1，一种非选择性Ca2+渗透性阳离子通道，已被证明可以将机械信号传递到巨噬细胞，从而可以检测机械应力。研究表明，Piezo1在骨组织中被下调，从而减缓骨折愈合，而其特异性激动剂激活Piezo1可加速骨折愈合和软骨转化为骨骼。此外，张力可以影响巨噬细胞功能和向M2的极化，并证明了10%的应变强度是激活M2型巨噬细胞的最佳选择。最近的研究表明，巨噬细胞通过促进血管生成和成骨，至少部分通过分泌转化生长因子（TGF）在骨形成中起着至关重要的作用。体内研究也表明，TGF-β1对骨修复至关重要。然而，巨噬细胞介导骨骼发育的机制仍然知之甚少。

尽管大量研究表明巨噬细胞对间充质干细胞（MSCs）的成骨作用，但在机械张力下，哪种巨噬细胞表型对MSC有利尚无定论。在南京医科大学附属口腔医院口腔正畸科、苏州大学附属独墅湖医院口腔科及江苏省口腔疾病研究重点实验室联合团队的一项研究中，创建了一个张力细胞模型来研究机械应变如何影响巨噬细胞的表型转化，发现最佳机械应变幅度表现出强大的免疫调节作用并促进M2巨噬细胞极化。该研究证明了Piezo1介导的钙内流变化以及p53乙酰化和去乙酰化，导致巨噬细胞向M2极化，分泌TGF-β1并促进BMSC成骨。研究成果发表在Cell Proliferation期刊题为“Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1”。

首先，鉴于M2巨噬细胞可以诱导MSCs成骨分化，因此，研究人员假设机械张力会刺激M2型巨噬细胞转化，导致BMSCs启动成骨。实验将RAW264.7细胞暴露于10%，0.5 Hz的循环正弦连续拉伸应变0-6小时以检查巨噬细胞的变化（图1 A），发现随着时间的延长，巨噬细胞上出现了更多的伪足，表明存在更多的M2型巨噬细胞，且M2巨噬细胞释放主要细胞因子的表达水平也升高。

为了研究巨噬细胞对张力的极化响应，对M1-和M2-极化巨噬细胞进行蛋白质印迹分析，发现应变增加了RAW264.7细胞中CD206+细胞的比例，进一步表明应变改变了巨噬细胞的表型。此外，对F4/80和CD206（M2标志物）进行了双重免疫染色，发现M2巨噬细胞的增加在第2h更为明显，RAW264.7细胞强烈表达F4/80。这些结果表明，张力以时间依赖性方式导致巨噬细胞极化为M2型，并且在2h时影响变得更加明显。因此，2h便作为进一步研究的时间点。

为了检测巨噬细胞衍生培养基是否对BMSCs的迁移有影响，将BMSCs和巨噬细胞间接共培养（图1 A）。结果显示，2h张力刺激时迁移潜力最大（图1 B）。此外，与RAW264.7细胞间接共培养的BMSCs增殖也受到影响，不同张力处理组（0、1h、2h、4h、6h）的BMSCs均表现出更高的增殖潜力，且在2h时出现峰值（图1 C、D）。通过划痕愈合试验检测BMSCs的横向迁移能力，发现接受条件培养基的细胞在第2h内显示更大的横向迁移能力（图1E）。这说明，来自张力刺激的RAW 264.7细胞的条件培养基显著促进了BMSCs的增殖和迁移，表明它可能通过增强干细胞归巢对组织愈合产生积极影响。

图1张力下的巨噬细胞条件培养基促进了BMSCs的增殖和迁移。

接下来，为了研究巨噬细胞免疫反应对成骨分化的影响，在不同暴露时间的张力下在各自的条件培养基中刺激BMSCs向成骨细胞分化。值得注意的是，2h张力组BMSCs的成骨潜力显著增加，成骨相关标记物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白质表达水平显著上调。这说明，在免疫环境中，2h的拉伸应变可能通过控制M2巨噬细胞极化来促进成骨。

为了确定为什么施加应力会影响巨噬细胞极化，实验检测了钙离子信号，发现与其他通道相比，Piezo1的表达非常高。因此，研究人员假设张力诱导的巨噬细胞极化与Piezo1介导的钙内流密切相关。根据RT-PCR和细胞免疫荧光结果，Piezo1在应变2h后显著升高。通过敲低Piezo1，发现了p53信号通路，与对照组和其他时间段相比，张力刺激1h后乙酰化p53的荧光强度非常高。

然而，p53的乙酰化以及巨噬细胞极化是否可能受到机械应力的影响还不确定，因此敲低Piezo1以研究其是否对p53及其乙酰化有影响，发现敲低Piezo1增加了乙酰化p53的表达。由于乙酰化p53与iNOS的变化一致，实验又探讨了Piezo1缺失是否会改变巨噬细胞极化，发现敲低Piezo1后张力刺激下RAW264.7细胞中促炎基因和M2巨噬细胞标志物显著下调。通过建立对照组、Piezo1敲低组和Yoda1激活Piezo1组，发现Piezo1激活组的巨噬细胞几乎全部为M2型，Piezo1敲低组的iNOS表达量几乎是对照组的一半。这些数据表明，Piezo1对于巨噬细胞极化为M2表型至关重要。

有趣的是，Piezo1敲低导致钙内流减少，在向培养基中加入1 μL/mL Yoda1和2h机械张力刺激后，巨噬细胞中钙内流显著增加（图2 A）。此外，BMSCs的迁移和增殖与钙内流的趋势相一致，应变2h后Yoda1的给药对BMSCs迁移的影响最大。Piezo1敲低后，巨噬细胞的条件培养基对BMSCs几乎没有影响（图2 B、C）。进一步检测BMSCs的成骨分化能力，发现在相同条件下，Piezo1过表达后，巨噬细胞的上清液大大增加了BMSCs的成骨能力。相反，在巨噬细胞张力暴露2h后，敲低Piezo1对条件培养基中的BMSCs几乎没有影响（图2 D-F）。总体而言，Piezo1对机械力的传递至关重要，甚至可以调节机械张力是否会影响巨噬细胞极化，从而影响BMSC的迁移、增殖和成骨分化。

图2 Piezo1敲低抑制BMSCs的增殖、迁移和成骨分化。

巨噬细胞极化后产生TGF-β1等对BMSC成骨有影响的细胞因子，因此评估了巨噬细胞分泌的TGF-β1在张力下的mRNA和蛋白水平。结果表明，机械张力可以刺激TGF-β1的分泌，特别是在2 h。在向间接共培养系统加入不同剂量的TGF-β1抗体12-48h后，不同处理组的BMSCs增殖潜力均显著降低，迁移能力也显示相似的趋势。此外，TGF-β1抗体处理显著降低了BMSCs的成骨表达。这表明，机械张力导致巨噬细胞向M2极化并释放TGF-β1，进而促进BMSCs的迁移、增殖和成骨分化。

zuihou，研究人员建立了一个小鼠运动模型来研究Piezo1和TGF-β1在骨再生过程中的作用，分为久坐小鼠（对照组）和运动小鼠，并注射水、Piezo1抑制剂（GsMTx-4）或TGF-β受体I、II抑制剂（LY-364947）。结果显示，跑步显著增加了小鼠的骨量，但当Piezo1被抑制时，机械力传递也停止了，且GsMTx-4注射组的骨量与对照组几乎相同。巨噬细胞释放的TGF-β1在TGF-β受体I、II被阻断后未能发挥作用，导致小鼠胫骨骨修复受损（图3 A）。HE染色结果显示，跑步组骨小梁数量显著增加，然而，对照组和接受药物注射组的骨小梁明显减少（图3 B）。免疫荧光染色显示，跑步可显著提高F4/80+阳性巨噬细胞的TGF-β1分泌，但Piezo1抑制剂显著阻碍了这种作用（图3 C）。因此，抑制Piezo1大大降低了巨噬细胞分泌的TGF-β1，从而减少了运动引起的体内骨量增加。

图3 TGF-β1和Piezo1的敲低均可降低跑步小鼠的骨重塑。

图4图形概要。Piezo1介导的机械张力刺激巨噬细胞极化和TGF-β1的分泌，促进成骨分化。p53的乙酰化和去乙酰化在这个过程中起着重要作用。

总之，该研究发现机械力通过Piezo1介导钙内流、p53乙酰化和去乙酰化的变化，诱导巨噬细胞向M2极化，分泌TGF-β1并促进BMSCs成骨。这表明Piezo1介导的巨噬细胞机械信号传导是骨骼免疫学的基础，为今后临床治疗骨外伤、骨质疏松和颌骨牵引提供线索。

参考文献：Cai G, Lu Y, Zhong W, Wang T, Li Y, Ruan X, Chen H, Sun L, Guan Z, Li G, Zhang H, Sun W, Chen M, Zhang WB, Wang H. Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1. Cell Prolif. 2023 Sep;56(9):e13440. doi: 10.1111/cpr.13440. Epub 2023 Mar 7. PMID: 36880296; PMCID: PMC10472522.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36880296/

2022 Journal Impact Factor (Clarivate):8.5

Online ISSN:1365-2184

Print ISSN:0960-7722

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