钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）恩格列净（EMPA）已被批准用于治疗心力衰竭，因为它对伴和不伴糖尿病患者的心血管均有益处。EMPA对心血管的保护作用可能部分解释为其对内皮细胞（ECs）的直接作用。

EMPA在ECs中显示出强大的抗氧化作用。活细胞图像显示，在TNF-α刺激的静态人ECs中，EMPA抑制ROS的产生并恢复NO生物利用度。近，研究发现SGLT2i还能抑制暴露于10%拉伸应力下的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）中ROS的产生和细胞通透性的增加，揭示了EMPA对动态培养的ECs也发挥保护作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）1/4抑制剂GKT136901降低了10%拉伸应力下ECs中的ROS，其程度与EMPA相似，且与EMPA联合使用时对ROS降低能力也不会增强，这支持NOX作为关键介质参与EMPA的抗氧化作用。

暴露于TNF-α和循环拉伸会增加ECs和心肌细胞中钠氢交换体（NHE）的活性，导致细胞内钠（Na+）增加。据推测，Na+通过钠钙交换体（NCX）增强胞质Ca2+来触发ECs内ROS的产生，从而刺激Ca2+依赖性蛋白激酶C（PKC）亚型。PKC活性升高，尤其是PKC-β，在人ECs的NOX活化和ROS产生中起主导作用。先的研究表明，SGLT2i直接抑制NHE，并且用EMPA或Cariporide（NHE抑制剂）降低NHE活性可抑制受到增强的拉伸和TNF-α刺激的人ECs中ROS的产生。然而，EMPA对细胞内Ca2+和PKC活性的影响在这些研究尚未调查。

近，在荷兰阿姆斯特丹大学医学中心及德国石勒苏益格-荷尔斯泰因大学麻醉学与重症监护医学系联合课题组的一项研究中，假设EMPA通过阻止PKC激活来抑制拉伸诱导的NOX活化和ROS生成。研究人员旨在探讨PKC在拉伸刺激的ECs中参与EMPA降低ROS的作用，以及EMPA抑制PKC的上游信号通路。研究成果发表在Redox Biology期刊题为“Empagliflozin prevents oxidative stress in human coronary artery endothelial cells via the NHE/PKC/NOX axis”。

先，将HCAECs暴露于4或24小时循环拉伸（1Hz）下，5%的拉伸幅度作为生理对照，10%幅度是损伤模型。与5%拉伸相比，10%拉伸增加了HCAECs中的PKC活性（图1 B），1 μM EMPA和10 nM LY-333531（PKCβ抑制剂）还原了PKC活性（图1 B）。EMPA和LY-333531均可阻止10%拉伸下HCAECs中NOX活性，但两种药物的联合治疗不能增强这种活性（图1 C）。这些数据表明，EMPA通过抑制10%拉伸下的HCAECs中的PKC活性来抑制NOX激活。

EMPA和LY-333531均降低了10%拉伸诱导的ROS生成，联合处理无额外效果（图1 D）。LY-333531恢复了10%拉伸后细胞VE-钙黏蛋白的丢失和通透性的增加（图1 E、F）。免疫荧光染色显示，10%的拉伸显著破坏了由VE-钙粘蛋白形成的细胞间连接，而LY-333531可以阻止这种破坏（图1 G）。这表明，EMPA可以防止由10%拉伸引起的细胞通透性破坏。当LY-333531与EMPA联合使用时，其内皮保护作用没有进一步被放大，说明这两种化合物具有相似的保护机制（图1 E、F）。这些数据表明，EMPA通过抑制PKC活性来降低10%拉伸下内皮细胞中增加的ROS生成和细胞通透性。

此外，10 nM PKC激活剂PMA刺激了5%拉伸下ECs中ROS的产生，表明PKC是HCAECs中氧化应激的关键介质之一。GKT136901的应用消除了NOX活性的增加，证明NOX1/4是促进拉伸下ECs中NOX活化的主要亚型。

以上数据表明，EMPA通过抑制PKC活性改善拉伸诱导的内皮功能障碍。

图1 EMPA通过抑制PKC活性减弱拉伸诱导的氧化应激和细胞通透性。

为了探究HCAECs中胞质Ca2+和氧化应激的功能关系，应用0.2 μM离子霉素（IONO）增强细胞内Ca2+，并激活内皮细胞中的PKC。使用特异性siRNA转染可使PKC-β表达降低80%，消除了接受IONO的HCAECs中NOX活性和ROS产生的增加。此外，PKC-β敲低阻断了10%拉伸下NOX的活化，表明PKC-β是拉伸相关氧化应激的介质。

在静态HCAECs中，EMPA、NCX抑制剂ORM-10962和钙螯合剂BAPTA-AM降低了细胞内Ca2+，EMPA和NCX抑制剂ORM-10962的联合使用未导致Ca2+的进一步降低（图2 A），表明EMPA可能通过抑制NCX在HCAECs中降低Ca2+。在暴露于10%拉伸的细胞中，BAPTA-AM和ORM-10962都阻止了由10%拉伸诱导的增强的PKC活性和氧化应激（图2 C、D、E）。此外，BAPTA-AM和ORM-10962都恢复了10%拉伸后增加的细胞通透性。BAPTA-AM阻止了10%拉伸下HCAECs中VE-钙粘蛋白的破坏，提示细胞内Ca2+是拉伸相关内皮屏障功能障碍的中介。进一步验证NCX1作为拉伸相关PKC激活的中介作用，结果表明，NCX1的敲低阻止了由10%拉伸引起的PKC活性的增加。

上述数据表明，EMPA可能会通过NCX降低细胞内Ca2+，导致10%拉伸下HCAECs中的PKC活化和氧化应激的抑制。

图2 EMPA可能会通过NCX降低细胞内Ca2+，导致10%拉伸下HCAECs中的PKC活化和氧化应激的抑制。

NHE抑制剂Cariporide阻止了10%拉伸诱导的PKC活性增加，与EMPA联合使用时对PKC抑制作用没有增强。与单独使用Cariporide相比，和EMPA的联合对拉伸增强的NOX活性具有相似的抑制能力。进一步的实验表明，钠泵抑制剂哇巴因（ouabain）上调暴露于5%拉伸下HCAECs中ROS的产生。这表明，EMPA通过抑制NHE/Na+通路抑制拉伸诱导的PKC活性和NOX活化。

实验研究了HCAECs中EMPA是否通过抑制NHE活性和减少胞质Na+来降低细胞内Ca2+。Cariporide可降低静息ECs中Ca2+（图3 A），揭示了人ECs中NHE活性降低与细胞内Ca2+降低之间的因果关系。令人惊讶的是，Cariporide与EMPA的组合比单独使用Cariporide发挥了Ca2+抑制作用。

为了探究HCAECs中NHE1、胞质Na+和NCX1在Ca2+动员中的相互作用，在Cariporide或Ouabain存在下，在NCX1敲低细胞中测量Ca2+。NCX敲低导致接受Cariporide的HCAECs中Ca2+的进一步减少（图3 D），而NHE抑制剂没有降低Ca2+。此外，NCX敲低消除了由Ouabain引起的细胞内Ca2+的增强（图3 E），表明累积的胞质Na+通过NCX可以触发细胞内Ca2+的增加。这些数据表明，EMPA可能通过抑制Na/NCX轴降低胞质Ca2+，这种作用部分由NHE介导。

值得注意的是，目的研究显示10%拉伸或EMPA对PKC-β、NOX4、NCX1和NHE1的mRNA和蛋白质水平没有显著影响，这表明EMPA的内皮保护作用不是由这些基因表达的变化介导的。



图3 EMPA通过Na+/NCX途径减少细胞内Ca2+，这部分是由NHE抑制介导的。

图4结果概要。

EMPA通过抑制NHE/Na+/NCX轴降低细胞内Ca2+，进而阻止10%拉伸诱导的PKC活性和NOX活化，并抑制ROS的产生。

总之，该研究证明了，在机械力作用下HCAECs中EMPA对PKC抑制的新作用，这也可能是解释观察到的SGLT2i对暴露于不同病理刺激（例如高血糖、炎症细胞因子、循环拉伸）的细胞的抗氧化作用的主要途径。使用机械激活的HCAECs，研究进一步表明，EMPA通过NHE和NCX等离子通道调节细胞内离子稳态（例如Na+和Ca2+）有助于改善内皮功能障碍。这些发现提高了关于SGLT2i对心血管益处的理解。

参考文献：Li X, Wang M, Kalina JO, Preckel B, Hollmann MW, Albrecht M, Zuurbier CJ, Weber NC. Empagliflozin prevents oxidative stress in human coronary artery endothelial cells via the NHE/PKC/NOX axis. Redox Biol. 2024 Feb;69:102979. doi: 10.1016/j.redox.2023.102979. Epub 2023 Dec 2. PMID: 38061206; PMCID: PMC10749278.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38061206/

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