一种用于大肠杆菌培养代谢追踪的实时自适应氧传递速率估算器
Matthew Pepper, Li Wang, Ajay Padmakumar, Timothy C. Burg, Sarah W. Harcum, Richard E. Groff
引言
氧气和二氧化碳尾气测量为好氧生物过程的估计与控制方法提供了应用基础。德国黑尔滕市的BlueSens公司提供的尾气传感器，其氧气和二氧化碳摩尔比测量精度可与作为行业标杆的质谱仪相媲美，成本却仅为后者的一小部分。成本的降低使得为每个生物反应器配备专用传感器成为可能，从而实现更复杂的生物过程实时估计与控制。
直接从任何类型的尾气测量中计算氧传递速率（OTR）在控制应用中存在问题，因为气体传输动态和传感器动态会导致计算出的OTR信号产生衰减和延迟。本报告的主要目标是描述一种状态估计器，它结合尾气、搅拌转速和溶解氧测量，能够实时预测真实OTR，且无衰减或延迟。预测的OTR可用于多种控制和估计目的，例如判断培养物处于氧化代谢还是溢流代谢状态。
图1 -搅拌式生物反应器中的氧气浓度，进气浓度为b₀，离开液体的气体浓度为b₁，顶空气体浓度为b₂，传感器报告的浓度为b₃。
背景：OTR 动态
在搅拌式生物反应器中，进气在被尾气传感器测量之前会经过两个阶段。图1展示了生物反应器及配套尾气传感器。进气中氧气浓度已知，为b₀。气体从反应器底部进入，旋转叶轮将气泡打碎，促进氧气被培养物吸收。进气浓度b₀与离开液体的气体浓度b₁之差，代表转移到液体中的氧气量V₁。假设气体质量流入等于流出，该差值可用于计算液体中的OTR，
（1）
其中，Mf为质量流量，ρO2为25℃时的氧气密度，Vl为液体体积。OTR也可通过搅拌转速和溶解氧浓度进行建模。
（2）
其中kLa为氧传递系数，C *为液体的最大溶氧能力，C为当前溶解氧浓度，N为搅拌转速。kLa与搅拌转速N的关系被建模为在搅拌转速N0附近呈线性关系。
离开V1的气体与顶空体积V2内的气体混合，形成氧气浓度b1。该过程为标准混合模型。
（3）
其中Mf为质量流量，浓度b2由BlueInOne传感器采集，传感器输出b3被建模为一个时间常数为τ2的一阶线性系统。
（4）
显然，直接由浓度b3计算得到的OTR，会与由浓度b1计算得到的真实OTR存在显著差异。
估计器设计
状态估计器结合系统的可测输出、输入以及已知动力学特性，来预测系统中无法直接测量的状态变量。使用自适应状态观测器时，除部分未知或时变参数外，系统的其他动力学特性均为已知。
在前文介绍的生物反应器系统中，氧气浓度的动态特性由状态变量b2和b3描述，其变化规律遵循式(3)和式(4)。系统的输入为浓度b1，该值无法直接测量，但可通过式(1)和式(2)，由搅拌转速计算得出。
（5）
模型中的所有参数，除了描述搅拌转速与kLa关系的参数a0和a1外，均可提前可靠标定。这些参数极难确定，且在培养过程中会缓慢变化。本报告所述估计器采用基于BlueSens传感器测量值的自适应算法，实时识别可能随时间变化的参数a0和a1。在这些参数得到良好估计后，可利用式(2)，通过搅拌转速和溶解氧浓度准确预测OTR。
估计器数学原理
该自适应估计器基于文献[6]的结构，下文将简要介绍其数学原理。估计器以传感器和传输动力学（式(3)至(5)）为基础，改写为可观标准型的状态空间模型。
该自适应估计器可同时估计状态变量b₂和b₃，以及参数a₀和a₁。估计器由已知变量b₃、C、N、V₁和V₂驱动。该自适应估计器由下式给出：
其中，e等于x估计值减去x真实值，e1等于y估计值减去y真实值，φ0为[0, a0估计值与真实值之差]的转置向量，φ1为[0, a1估计值与真实值之差]的转置向量。v0和v1为辅助变量。
针对这两个未知参数的自适应律设计为：φ0估计值的导数等于负的 γ0乘以e1再乘以 Ω0，φ1估计值的导数等于负的 γ1乘以e1再乘以 Ω1，其中 γ0和 γ1为观测器增益。
其他变量设计为：Ω0等于[s/(s+4), 1/(s+4)]乘以f0 (t)除以 τ2，Ω1等于[s/(s+4), 1/(s+4)]乘以f1 (t)除以 τ2。
注：此处的符号s表示微分算子d/dt
表1包含了氧气动力学模型的所有参数。已知kLa会在发酵过程中缓慢变化，且受消泡剂添加、液体粘度变化等多种因素影响；因此，式(2)所示线性模型中的参数为时变参数，只能近似确定。
实验部分
生物反应器系统
本实验所用生物反应器系统为赛多利斯Biostat B型5L玻璃反应釜及数字控制单元（DCU）。DCU连接有pH探头（美国雷诺市Hamilton公司）、温度探头（赛多利斯）和溶解氧探头（Hamilton）。所有数据均在Matlab 2012a运行的Simulink模型中，通过OPC协议采集：pH、温度、溶解氧数据每15秒采样一次；BlueSens BlueInOne尾气分析仪输出的相对湿度、温度、压力及氧气、二氧化碳体积百分比数据每10秒采样一次；喷射气体的质量流量由质量流量控制器（美国康涅狄格州斯坦福德市 ΩEngineering公司）测量，每5秒采样一次；两台天平（美国新泽西州Parsippany市Ohaus公司）记录葡萄糖和碱液的投加量，每5秒输出一次重量数据。
图2：Biostat-B型生物反应器系统，包含5L反应釜、搅拌电机、DCU控制单元、BlueSens BlueInOne传感器及称重天平。
传感器特性标定
为在系统中实现自适应OTR估计器，我们通过多组标定实验分析了BlueInOne传感器的性能。
组实验用于测定传感器的延迟和响应时间t4。以往文献报道的响应时间和测量延迟数据来自其他型号传感器，且测试流量远低于本实验（0.040 vs 2 L/min）。实验中，进气b0直接接入BlueInOne传感器，绕过搅拌釜，仅测量传感器本身的动态特性。
实验过程中，进气组分和流量不断变化：气体从氮气切换为空气，每5分钟切换一次；循环两次后，流量以1 L/min为步长从2 L/min提升至8 L/min。
实验测得传感器延迟为15秒（气体组分变化后传感器开始响应的时间），响应时间为55秒（传感器达到最终测量值63%的时间常数）。数据表明，响应时间不随气体流量增加而变化，说明BlueInOne的测量腔室在远高于最大工作流量时仍能被充分吹扫。
第二组实验探究了传感器在1.02到1.67 bar压力变化下的测量精度和稳定性，以此评估该传感器在需要对顶空加压的实验中的适用性。
Biostat-B反应釜的最大压力上限为1.63 bar。BlueInOne传感器经厂商认证的准确工作压力范围为0.8到1.3 bar，最高耐压为2 bar。
实验首先对BlueInOne进行单点校准，输入气体为空气，其氧气体积分数恒定为20.97%。与前一组实验相同，输入气体直接接入BlueInOne传感器的进气口。质量流量以1 lpm为步长，在1到9 lpm之间变化。质量流量的增加使传感器内部压力从1 bar升至1.67 bar（见表2）。
图3 -测量稳定性结果，BlueInOne的压力补偿算法可快速校正压力阶跃变化导致的误差。在测试压力范围内，最终校正值的变化小于1%。
每次流量和压力阶跃变化后，测量值会因腔室内氧气含量增加而出现尖峰。补偿软件会快速校正测量值，平均仅影响64 (±19)秒的数据。在此压力范围内，报告的氧气体积分数从20.97%漂移至21.1%，误差小于1%。正如预期，当压力超过1.3 bar时，基线读数开始漂移。即使超出认证范围，压力补偿软件仍能提供准确测量，表明在压力恒定或缓慢变化的条件下，传感器可提供准确稳定的读数。
生物反应器条件
本研究进行了两组实验以测试OTR估计器的准确性。组实验在生物反应器模拟器上实现了OTR估计器，输入和输出数据的延迟特性与Sartorius Biostat-B生物反应器、BlueInOne传感器和两台天平一致。大肠杆菌的模拟行为基于1999年Xu等人的研究。第二组实验中，大肠杆菌MG1655 pTV1GFP在基本培养基中培养12小时，生物反应器的接种光密度（分光光度计测量）为0.5 OD。两组实验中，生长速率均控制在0.25 h-1，培养体积为1.67 L，进气质量流量为3 L/min。
OTR 估计器验证
采用脉冲形式的进料速率扰动测试OTR估计器追踪大肠杆菌代谢的能力。该脉冲将进料速率提高至当前速率的四倍，旨在提高葡萄糖浓度，使大肠杆菌进入溢流代谢状态。虽然溢流代谢对大肠杆菌不利，但该进料脉冲持续时间较短，任何副产物都会被快速消耗。追踪大肠杆菌从氧化代谢到溢流代谢的转变，有助于确定最佳进料速率，使培养物维持在溢流代谢的临界点，从而最大化氧化代谢效率。
在图4中，实验结果（A、B）显示，随着大肠杆菌代谢活动对葡萄糖脉冲的响应增强，OTR和OUR显著升高，这与模拟结果（图4 D、E）中的行为一致，表明实验结果具有合理性。需注意BlueInOne测量值计算的OTR（OTRsens）的响应，可观察到滤波效应：OTRsens的峰值高度低于OTRest，且两者峰值之间存在延迟。
OTRest的响应几乎是即时的，而OTRsens的峰值直到5分钟脉冲结束后才出现。OTRest的平台效应表明培养物进入了溢流代谢状态。在溢流代谢中，氧化代谢因葡萄糖过量而饱和，细胞吸收的多余葡萄糖会通过厌氧途径转化为乙酸，高浓度乙酸会抑制生长（2 g/L）。OTRest的曲线表明，氧化代谢能够以更高的速率处理葡萄糖，因此进料速率可显著提高。若使用OTRsens获得相同数据，则需要长得多的脉冲，这会导致乙酸产量大幅增加。
实际实验与模拟实验中的大肠杆菌行为非常相似，验证了OTR估计器增益的调优效果（图4 A、B、D、E）。在模拟实验中（图4 D、E），OTRest能很好地追踪真实OTR，表明kLa参数a0和a1的估计已收敛到其真实值。实际发酵过程中的kLa数据绘制于图5，数据点分布表明kLa与搅拌转速呈线性变化，验证了我们的线性模型的合理性。由于培养时间较短，细胞密度未对培养基粘度产生影响，因此线性模型是适用的。
图4 -葡萄糖脉冲实验，通过施加进料速率脉冲（C），测试OTR估计器在实际（A、B）和模拟（D、E）生物反应器系统中的追踪性能。在图A中，OTR估计器能够准确追踪氧传递速率（OTR），相比直接使用BlueInOne测量值计算的OTR，能更好地反映大肠杆菌的代谢状态。系统的衰减和延迟效应在图A、B中清晰可见。
图5 -实验氧传递系数，由OTR估计器计算得到的kLa值。在12小时发酵过程中，kLa与搅拌转速保持近似线性关系，该结果验证了kLa模型的合理性。
结论
OTR估计器通过消除顶空和传感器动态对尾气氧气体积测量的影响，提供了更准确的OTR曲线。BlueInOne传感器的测量结果准确且稳定，使自适应算法能够同时估算未知的kLa和OTR值。该OTR估计器能够准确追踪大肠杆菌的代谢状态，将成为开发氧化代谢最大化控制器、提高生物量产量的关键组成部分。
研究人员使用尾气传感器开发估计与控制算法已有20余年。然而，这些算法在工业领域的应用进展缓慢，对行业发展造成了不利影响[7]。从神经网络到模型预测控制，BlueInOne传感器为学术界和工业界研究人员提供了探索和实施下一代生物过程控制技术的工具。
参考文献
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细胞培养与优化实验室隶属于克莱姆森大学生物工程系（BioE），由Sarah Harcum（邮箱：harcum@clemson.edu）指导。本研究由克莱姆森大学电气与计算机工程系（ECE）仿生系统实验室合作完成，该实验室由Richard E. Groff（邮箱：regroff@clemson.edu）指导。本项目旨在开发适用于细菌及哺乳动物细胞发酵与培养的估计与控制策略。本研究受美国国立卫生研究院（NIH）**生物医学研究中心（COBRE）**资助，项目编号：P20GM103444。
项目团队
Matthew E. Pepper（右） 电气与计算机工程系博士生Li Wang（中） 电气与计算机工程系硕士生Ajay Padmakumar（左） 电气与计算机工程系硕士生Dr. Timothy C. Burg电气与计算机工程系副教授Dr. Sarah W. Harcum生物工程系副教授Dr. Richard E. Groff电气与计算机工程系副教授
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