通过闭环在线监测O₂和CO₂浓度评估海洋细菌对石油的生物降解作用
A.G. Valladares Juárez, N. M. Enwena, M. Schedler, R. Müller
引言
2010年4月，墨西哥湾 “深水地平线”（DWH）油井爆炸事故造成了迄今为止最严重的深海原油泄漏事件。在86天内，约500万桶原油流入海洋。此次泄漏对海洋栖息地的影响以及原油的最终去向仍未被充分了解。细菌在海洋溢油的石油降解过程中扮演着关键角色。该海域的高压、高盐和低温环境，使得原位研究原油降解机制十分困难。因此，在实验室中研究原油生物降解机制至关重要。为此，本研究搭建了高压反应器（400 bar）与低压反应器（1 bar），用以对比室温条件（1 bar，20℃）与 “深水地平线” 油井附近深海环境（150 bar，4℃）中矿物油的生物降解速率。
由于原油的疏水性，其与海水、细菌混合后会形成至少两种不混溶的相，导致无法对系统进行代表性取样。此外，原油中的低分子量组分在取样过程中易挥发，会对实验结果造成干扰。目前，我们主要通过离线分析细菌浓度，或在每个时间点牺牲一个反应器进行气相色谱分析来间接量化原油降解程度，这种方法劳动强度极大。为了实时量化原油生物降解的程度，需要在线测量以下一个或多个参数：细菌浓度、氧气浓度、二氧化碳浓度或原油浓度。氧气和二氧化碳的连续测量值可与原油的消失和细菌的生长建立关联。
研究目标
本研究的目标是使用BlueInOne气体分析仪（BlueSens gas sensor GmbH，德国黑尔滕）监测新分离的海洋细菌对原油的生物降解速率。由于生物降解是一个相对缓慢的过程，无法直接测量氧气或二氧化碳的实时变化。因此，本研究设计了一个闭环反应器，用于监测累积耗氧量和二氧化碳生成量。
图1：用于监测海洋细菌与原油共培养过程中CO₂和O₂浓度的闭环装置
装置描述
其中一台低压反应器被改装为带气密接口的装置，并通过柔性管路连接至BlueInOne Cell分析仪（图1）。为了使气体以闭环模式通过分析仪，使用蠕动泵以3 rpm的转速循环空气。反应器由磁力搅拌器搅拌。同时，一个气密的三口Schott瓶也连接到分析仪：两个接口用于气体循环，第三个接口用于取样测定细菌浓度（图2）。装置的整体示意图见图3。
材料与方法
本研究中使用的石油降解细菌菌株由西佛罗里达大学的Joe Lepo教授和Wade Jeffrey教授提供。这些菌株是从墨西哥湾 “深水地平线” 事故前后的海洋样品中分离得到的，分为参考菌株（事故前分离）和测试菌株（事故后分离），并作为实验的接种物使用。所有发酵实验均采用分批培养模式进行。
图2：用于监测海洋细菌与原油共培养过程中CO₂、O₂浓度及细菌浓度的闭环装置
图3：反应器装置示意图，其中BlueInOne分析仪与泵在气相中构成闭环循环回路。图中同时展示了图2装置中使用的液体取样口。
为解决氧气限制问题，反应器中仅加入1/4体积的基础培养基，其余空间为空气。实验以0.03%~0.1%（v/v）浓度的路易斯安那甜原油或其主要组分（萘、二甲苯、甲苯、十六烷）作为碳源，接种10%体积的细菌菌液。O₂和CO₂数据由BlueVis软件记录。
实验在起始点、结束点取样；带有取样口的装置则在实验过程中持续取样，以测定细菌数量。BlueInOne分析仪会在系统提示时用空气自动校准，校准数据自动保存，数据存储稳定且操作便捷。
结果
石油降解细菌在原油及石油组分中的生长情况
菌株DWH06A在琼脂培养基上可降解路易斯安那原油、十六烷、二甲苯和甲苯；在液体基础培养基中也能降解路易斯安那原油，细菌细胞数量变化见图4。实验初期装置的硅胶软管存在漏气问题，空气渗入反应器，表现为35小时后氧气浓度回升至初始的21%。后续实验中，装置改用PVC软管实现完全气密，解决了泄漏问题。
菌株GM2在琼脂平板上呈乳白色，在含十六烷的基础培养基中生长良好（图5），在含萘的培养基中生长一般，是本研究中细菌细胞数量最高的菌株。
菌株DF8在添加路易斯安那原油和十六烷的选择性基础培养基琼脂上生长良好；其在含1 mM十六烷的液体培养基中的培养结果见图6。菌株DS4P5无法降解任何石油组分，仅在琼脂平板上有微弱生长；以路易斯安那原油为碳源时完全不生长，O₂和CO₂浓度保持恒定（图7）。BlueInOne分析仪的监测数据验证了细菌密度的变化结果。
菌株DWH06B在含萘的琼脂平板上呈橙色，可降解路易斯安那原油、萘、甲苯和二甲苯，是能在含3% NaCl（与大洋盐度一致）的培养基中降解萘的菌株。该菌株可在液体基础培养基中降解甲苯（图8），且能在145 bar高压下良好生长，两种压力条件下的细菌细胞数量相近，但高压环境下无法直接监测O₂和CO₂变化，甲苯降解速率是否一致有待进一步研究。图8的发酵数据因分析仪与计算机的通讯错误未能完整记录，但该菌株以甲苯为碳源时可生长至1×10⁸CFU/mL，其降解特性值得深入研究。
菌株SY1（图9）可无迟滞期地降解萘，但耗氧量低于菌株GM2、DF8和DWH06B（后三者以十六烷和甲苯为碳源时）。
结论
溢油可被海洋细菌降解。氧气是好氧微生物生长和生物降解的关键底物，二氧化碳和生物量是生物降解的主要产物，可用于估算已降解的石油量。本研究测试了部分深海和表层分离细菌的降解能力，并筛选出了几株潜力菌株。由于该多相体系无法直接取样，BlueInOne分析仪的测量方法解决了这一难题，显著加快了新菌株的筛选过程。BlueInOne分析仪提供了关于石油生物降解的宝贵在线实时数据。
此外，我们证明BlueInOne分析仪可通过将尾气循环回发酵罐，用于监测代谢速率较低的分批发酵过程。这一新应用在实验室研究中极具吸引力：分析仪仅需几根软管即可连接到任何类型的反应器或发酵罐，通用性强、精度高，是监测氧气和二氧化碳的经济高效方案。
展望
使用BlueSens系统，可高效开展更多参数（如温度、菌株类型）的后续实验。BlueInOne分析仪也非常适合用于长期生物降解研究。
BlueInOne分析仪的另一潜在应用是：从加压反应器中采集气体样品，减压后送入分析仪。这些数据对于比较细菌在常压与深海高压环境下的代谢差异具有极高价值。
参考文献
1.Marcia K. McNutt, Rich Camilli, Timothy J. Crone, George D. Guthrie, Paul A. Hsieh, B. Ryerson, Omer Savas and Frank Shaffer. Review of flow rate estimates of the Deepwater Horizon oil spill. PNAS, 2012, 109(50): 20260-20267.
研究团队简介
由Müller教授领导的技术生物催化研究所环境生物技术课题组，主要于阐明环境污染物生物降解的新途径。为此，课题组从环境样品中分离出具有降解污染物能力的新细菌，并确定降解途径中的中间产物；针对有研究价值的新反应步骤，对相应的酶进行纯化、克隆、测序与表征。
生物降解是理解化学品（无论是有意释放的农药还是意外泄漏的石油）在环境中归趋的关键。目前，许多化学品的生物降解途径仍不明确，部分化学品的降解仅在特定条件下为人所知。因此，本课题组的研究旨在填补这些知识空白，并为环境问题寻找安方案。
第12年
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