驱动力受限细胞培养工艺中溶解二氧化碳的控制
摘要
生物工艺的一项根本要求是具备可放大性。工艺参数不受控产生波动，会造成“不可放大”问题。在哺乳动物细胞培养工艺中，pH、溶解氧（dO₂）与二氧化碳分压（pCO₂）被认为是关键工艺参数。但现有控制方案无法对这些参数实现相互独立控制，其中一大核心难点就在于二氧化碳分压的监测。
现有方案采用pCO₂电极，但该电极存在漂移问题。本文提出一套控制策略，使用尾气分析仪监测二氧化碳分压，并将其作为控制变量。
实际应用表明，在特定边界条件下，可实现pH、溶解氧、二氧化碳分压三者独立控制。经过有效性评估，证实二氧化碳传质过程属于驱动力受限。本研究在实验室规模低通气生物反应器中观测到驱动力受限现象，此前该现象仅见于大型生物反应器。
该技术可在确定条件下完成工艺控制，提升工艺稳定性。同时，能够显著简化低通气小型及实验室级细胞培养生物反应器的尾气分析流程，并提高其稳定性。
引言
已有大量文献研究各类工艺参数对工艺性能带来的影响，其中与规模相关的工艺参数备受关注。当前工艺放大与缩小过程出现的各类问题，大多源于对这些参数潜在的工艺影响认识不足。但生产过程中实际采集到的工艺相关测量数据却很少。
造成该现状的原因包括：①测量实时性；②缺乏工艺反馈；③无经济效益。针对哺乳动物细胞培养，已有大量文献充分阐述pH、溶解氧张力（dO₂）、二氧化碳分压（pCO₂）带来的影响，三者属于广泛认可的关键工艺参数。因此需要在确定的设计空间内完成pH、dO₂、pCO₂的监测与控制。
除温度与输入功率外，溶解氧与pH属于最常进行实时测量与控制的工艺变量。与之相反，溶解二氧化碳通常不做检测，或仅采用离线检测。根源在于溶解二氧化碳浓度监测难度大。目前已有可原位实时检测溶解二氧化碳的方法，原理基于二氧化碳可透过的半透膜；二氧化碳扩散进入缓冲液，改变缓冲液pH，通过检测缓冲液pH换算得到二氧化碳分压。但该pH电极在长时间工艺运行中会发生漂移；虽然可以通过规范样品处理完成零点重新校准，但技术实现难度很高。
基于该原理，Eisenkrätzer等人开发了pCO₂控制策略，但因其复杂度高，并未得到普及。本篇应用笔记介绍一种细胞培养工艺中不使用pCO₂电极实现pCO₂控制的方法。创新点在于采用气体分析仪监测二氧化碳分压，并以此实现pCO₂控制，规避易发生漂移的原位电极。
对比原位pCO₂电极，尾气传感器具备多项优势：①可长期输出稳定测量信号；②安装于无菌屏障外侧，不与物料直接接触；③可提供尾气分析的额外信息；④成本相对低廉；⑤应用广泛。
该测量方式最核心优势在于对系统做整体性考量：原位电极属于局部选择性测量，而尾气分析得到的是体系平均pCO₂。
材料与方法
全部实验在3.6 L Labfors 5生物反应器系统（瑞士Infors）开展，初始工作体积2 L。通气系统配置四台质量流量控制器，分别控制空气、氧气、二氧化碳、氮气，量程0.2 25 mL/min（瑞士Vögtlin Instruments）。总通气流量设定为30 mL/min，包含恒定5 mL/min空气流量，其余25 mL/min由其他气体累加得到。对应气液比vvm为0.010 0.015 Lₙ/(L·min)。
在线检测设备包括：pH电极（EASYFERM PLUS K8 200，瑞士Hamilton）、氧分压电极（VISIOFERM DO ARC 225，瑞士Hamilton）、二氧化碳分压电极（InPro 5000 (i)，瑞士梅特勒 托利多）、温度探头PT100（Infors）。
采用德国BlueSens公司BlueInOne Cell尾气分析仪在线检测尾气中氧气、二氧化碳、水蒸气组分。使用瑞士SoftCell公司的Lucullus软件作为工艺信息管理系统。控制器同时采用阶跃控制器与比例积分控制器。全部计算工作基于MATLAB（Mathworks，R2015a）完成。
培养温度37 ℃，环境常压。溶解氧设定点为空气平衡浓度的40%；二氧化碳分压设定点125 mbar；pH设定6.8。
结果
pCO₂监测
溶解二氧化碳（cCO₂）浓度监测难度较高。根据Sieblist的研究，二氧化碳传质需要区分体积传质系数受限模式与驱动力受限模式。可通过改变体积传质系数的工艺事件验证该限制模式，添加消泡剂就是此类典型事件。图1展示溶解氧与二氧化碳分压随时间变化曲线。在时间零点，加入定量消泡剂。可以观察到，添加消泡剂会显著影响溶解氧，但不会对二氧化碳分压产生影响。
图1：添加消泡剂后，原位测得氧气、二氧化碳分压的阶跃响应
假设微观膜理论成立，该现象只能用Sieblist等人的研究进行解释。由此证实：即使是小规模反应器（有效容积2 L），也会发生与传质驱动力相关的传质限制现象。
CHO细胞培养通气速率较低（30 mL/min），造成反应器内气相平均停留时间变长，这是本研究体系产生驱动力限制的主要原因。 由此得到两点结论：(i)大规模系统的典型问题，在小规模体系中同样会出现；(ii)不应采用Bonarius等人、Frahm等人的复杂算法，在给定工艺条件下估算溶解二氧化碳浓度，可采用亨利定律进行分析。因此，二氧化碳分压应当与溶解二氧化碳浓度呈正比。
因此，在驱动力受限工况下，尾气中的二氧化碳分压与原位测量结果具备等价性。理论上，尾气pCO2信号可作为溶解cCO2的控制变量。
溶解二氧化碳的控制
二氧化碳传质速率（CTR）同样可以用简单传质项描述（公式1）。
需要注意，c_CO2仅指溶解二氧化碳的浓度。其余所有碳形态（碳酸、碳酸盐以及碳酸氢盐）在本研究中均不作考量。根据膜理论，kL,CO2与kL,O2存在耦合关系。依据Frahm等人的研究，37 ℃条件下的细胞培养液可采用如下关联式[13]（eq.(2)）。
CTR同样会受kLa数值以及传质驱动力的影响。基于膜理论的关联式可以得出，在kLa受限工艺中，不能采用依赖kLa数值的控制方式。小规模体系中存在驱动力限制这一现象表明，依赖kLa数值的控制在理论上可行，但并非普遍适用。对于系统工况未知的情况（kLa数值未知或处于驱动力受限状态），出于控制稳定性考虑，不应使用依赖kLa数值的控制。该类控制方案投入使用的必要条件为体积比输入功率P保持恒定，同时气体表观流速sg保持恒定。因此，氧气与二氧化碳的完全解耦控制，需要对两种组分均采用基于驱动力的控制。该控制方式仅受系统总压(p)以及最大二氧化碳传质速率(CTRmax)的约束（eq.(3)）。
除溶解二氧化碳之外，其余碳形态也必须加以考虑。文献中已经对它们之间的相互关系给出足够精确的描述[8, 12, 13]。其中温度与pH会对解离平衡产生显著影响。需要根据待调控的碳组分来考量该平衡关系。生物工艺重点关注的组分主要为二氧化碳、碳酸以及碳酸盐。
通过气液两相界面的传质过程，可以直接调控溶解二氧化碳的浓度（eq.(4)）。受pH相关平衡的限制，无法对全部二氧化碳相关碳组分实现独立控制。由此可知，在物理化学层面无法实现pH与全部碳组分的完全解耦。但可以将单一二氧化碳碳组分调节至设定值。通过合理的实验设计，理论上能够分析各个二氧化碳碳组分带来的影响。pH变化应当视作溶解二氧化碳浓度的扰动变量，但该扰动可以通过改变传质驱动力进行抵消。需要注意，在监测溶解二氧化碳浓度时，系统可以脱离驱动力受限工况。为实现更加详尽的定量分析，可以开展实时仿真计算，该仿真需要采用膜理论，所需计算依据Minkevich与Neubert的研究文献[12]。在kLa数值受限的工艺阶段，不允许使用Minkevich和Neubert提出的方程组，此时可采用Boranius等人以及Frahm等人的模型。本文不再进一步探究pH变化对溶解碳浓度带来的影响。
图2：包含测量系统与控制系统全部相关组件的工艺流程图
在驱动力受限工艺中，二氧化碳传质速率会受到多个可操作工艺参数的影响，可调节参数包括总气体流量以及通气气流中的二氧化碳含量。相关控制回路流程图如图2所示。AC201代表PI控制器，其被控变量为原位测量的溶解氧dO2，操纵变量为氧气流量FO2。AC202为PI控制器，被控变量为在线测得的二氧化碳分压pCO2，操纵变量为二氧化碳流量FCO2。控制器AC203用于调节总气体流量FG，该控制器采用P‑TO模块，将氮气流量作为操纵变量。pH控制的死区为0.01，由PI控制器AC110完成调控。
图3：pCO2控制(A)、dO2控制(B)以及pH控制(C)对应的被控变量与操纵变量变化曲线。除平滑曲线外，图中还给出各参数95%置信区间。
哺乳动物细胞培养工艺中的应用
图3给出溶解氧、二氧化碳分压的被控变量与操纵变量随时间变化曲线。pCO2控制与dO2控制的置信区间均为±0.13[%]；操纵变量的置信区间为±0.10[mL/min]。进一步优化控制参数可以改善该结果，但从实际控制偏差来看，该优化并非必需。基于该控制策略，二氧化碳生成量与氧气消耗量的波动会直接体现在质量流量控制器信号上，因此可以直接从操纵变量中提取工艺动力学信息。其中二氧化碳流量与二氧化碳生成速率间接相关，氧气流量则与氧气消耗速率直接相关。因此这些信号可作为简易软传感器的输入变量，用于估算活细胞密度VCD。
除溶解氧与二氧化碳分压之外，还对pH值进行控制。图3‑C展示该套控制对应的被控变量与操纵变量时序曲线。pH控制的95%置信区间为±0.025[-]；图中酸/碱消耗量的置信区间为±0.12[g]，处于所用天平±0.1[g]的分辨率极限范围内。pH控制对应的操纵变量信号同样可以用于推导工艺动力学。
结论
本篇应用笔记旨在介绍一套控制策略，该策略以尾气分析仪监测得到的二氧化碳分压作为被控变量，实现pCO2的调控。
为达成该目标，本文设定四项子任务，得到如下结论：
(i)研究了弱通气实验室规模生物反应器内的二氧化碳传质，证实小型生物反应器中存在驱动力受限现象。该观测结果是细胞培养工艺放大与缩小过程中二氧化碳传质研究的重要前提。此外，该发现会影响二氧化碳传质速率的计算描述，能够显著简化对应系统模型，值得后续进一步研究。
(ii)在驱动力受限系统中，尾气分析仪测得的pCO2可以用作被控变量，此时可将二氧化碳进气流量作为操纵变量。
(iii)实验结果表明，整套控制策略在完整批次工艺运行过程中保持稳定；工艺的波动被转移至操纵变量，操纵变量更适合表征工艺动力学，例如可作为过程分析技术PAT体系下软传感器的输入信号。
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