面向分泌过程优化的软测量自适应补料控制
1 引言
抗体及抗体片段（ABF）是诊断与治疗领域极为重要、需求量巨大的工具，预计2012年市场销售额将达到560亿美元[1]。分子量更小的抗体片段具备若干药代动力学优势，例如实体瘤穿透能力提升、可局部给药，或是能够从血液循环血清中快速清除[2]。目前工业生产抗体大多采用真核表达系统，例如CHO细胞。这类成熟体系能够实现完整抗体的高滴度表达，但存在生产周期长、成本高昂的问题。因此，开发培养基组分简单、生产周期短、可实现高密度培养的细菌替代系统具有很高的应用价值。本研究使用的巨大芽孢杆菌，是替代大肠杆菌的优质生产宿主；该宿主表达效率高，成本更低，同时具备强大的蛋白分泌能力[3]。
不同于大肠杆菌等革兰氏阴性菌（具备外膜结构），巨大芽孢杆菌无外膜，表达且具备生物活性的抗体片段可直接从发酵上清液中收集获取。该类分泌过程受多种参数影响，实现良好的过程控制存在不小难度。已有研究表明，巨大芽孢杆菌的抗体片段分泌量提升，与菌体处于饥饿条件下的稳定期密切相关[4]。图1展示了稳定期促进蛋白分泌的潜在机制。饥饿条件下，细胞膜电位发生去极化，自溶素活性增强，细胞壁结构松弛，进而促进抗体片段等分泌型蛋白释放至上清液[5,6]。与此同时，有文献报道，分泌通路（Sec通路）部分组分受到时序调控；在稳定生长阶段的早期与持续阶段，蛋白分泌启动时表达量达到峰值[7,8]。此外，研究发现在饥饿阶段，PrsA、HtrA等参与蛋白折叠的细胞壁分子伴侣编码基因显著上调，进而促进异源表达抗体片段的正确折叠与释放。
本项目的核心难点：将“分泌行为与生长阶段相关” 这一机理，落地为合理可行的过程控制策略，同步提高生物量与抗体片段滴度。
本研究采用基于尾气分析的控制算法，构建补料策略；该软测量技术用于设定比生长速率。通过调控比生长速率，控制能够显著影响分泌效率的菌体细胞膜电位，以此直接调控并提升抗体片段向发酵上清液的分泌水平。
图1：巨大芽孢杆菌细胞中与生长阶段、饥饿阶段相关、直接影响蛋白分泌的作用机制。表格汇总各条件对生长速率、二氧化碳释放速率(qCO₂)、细胞膜电位（MP）以及抗体片段（ABF）分泌的具体影响，以此作为自适应过程控制策略的理论基础。
2 研究目的
本研究核心思路：通过优化补料策略，以及稳定期条件下生长时间（tGrowth）与分泌时间（tSec）的时间配比，优化巨大芽孢杆菌(YYBm1，EJBmD1.3scFv)[9]中溶菌酶抗体片段D1.3 scFv的合成与分泌水平。 前期实验表明，简单的延长分批培养，或是低比生长速率下指数补料的方案，产物滴度偏低、总收率不理想[4]。因此本文采用生长 饥饿/分泌交替循环策略，优化tGrowth/tSec)比值。 在生长阶段积累前体物质、提升生物量、合成抗体片段；随后切换至稳定期条件，进入抗体片段高效分泌阶段。 本研究将流式细胞仪作为额外过程监测手段，在单细胞层面考察不同生长阶段对菌体细胞膜电位（极化状态）的影响。
3 实验设计
3.1 振荡补料分批培养 —— 概念原理
为实现可重复、自动化的“生长 饥饿/抗体片段分泌”交替耦合工艺，建立基于时间的比生长速率μ振荡补料控制的补料分批策略。控制策略概览见图2。
该策略以指数补料算法为基础，通过两组余弦函数（公式1、2）实现随时间变化的比生长速率调控。选用余弦函数，目的是实现工艺自动化与可重复性，同时避免补料量突变，防止补料过量，或是乙酸等溢流代谢物骤然累积。 借助二氧化碳释放速率CER，结合随时间变化的比生长速率μ，估算实时生物量浓度。 通过这套整体调控方案，实现比生长速率、菌体细胞膜极化状态（MP）、抗体片段分泌效率三者同步联动。后续将对该控制策略做进一步详细阐述。 生物反应器控制、合成培养基配方、巨大芽孢杆菌菌株筛选、流式细胞检测方法均参照David等人2011年文献[4]。
图2：μ振荡补料（F）控制机制总览，该补料策略适配实时生物量浓度(X)。通过尾气分析得到二氧化碳释放速率(CER)与当前生长速率μset 0.25以此估算生物量。设定比生长速率μset具备时间依赖性，由两组余弦函数构建，并限定最大生长速率μmax。反应器内培养体积(V)根据取样体积与补料体积进行校正。
3.2 振荡补料分批工艺——数学基础
振荡补料分批策略以指数补料公式(1)为基础。由于补料持续动态调整，时间间隔趋近于0，因此eμxt项取值视为1。
设定比生长速率μset具备时间依赖性，基于两组余弦函数，实现生长阶段与饥饿阶段的振荡交替变化（图4(A)）。为得到特定变化曲线，需要合理选定\μmax（振幅）以及k1-3的常数参数。
由于设定的比生长速率持续变化，需要对实时生物量浓度X与培养体积V进行同步适配。 生物量浓度依靠软传感器估算，该软传感器基于二氧化碳释放速率（CER）与实际生长速率构建；用于补料计算的设定比生长速率μset，设置0.25小时的时间偏移。该处理依据实验结果：补料设定生长速率与实际菌体生长速率之间存在时间滞后。 由BlueSens®测得的实时CO₂、O₂尾气参数作为直接过程参数，是实现稳定可靠控制的必要条件。在呼吸商等于1的分批实验数据基础上，推导出CER/X与对应比生长速率μ之间的线性相关关系。
实际培养体积通过计入补料体积与取样体积进行计算确定。
4 结果
4.1 比例筛选：生长阶段 饥饿/分泌阶段
本研究核心目标是构建适配的生物过程控制策略，实现高细胞密度，同时保证分泌型ABFs具备高生产效率。 测试了多组生长阶段与饥饿阶段时长不同的补料分批工艺（图3）。确定生长阶段（1.5 h）与饥饿阶段（0.5 h）比例约为3，并将该比例应用于后续生物过程控制。
图3：筛选巨大芽孢杆菌YYBm1（EJBmD1.3scFv）体系中，不同生长阶段、饥饿阶段时长对ABF D1.3单链抗体比生产速率(qp)的影响。括号内数值代表对应比值(tgrowth,(exp)/tsecretion,(stat))。
4.2 μ振荡补料分批工艺
针对巨大芽孢杆菌分泌ABF D1.3单链抗体，采用基于时变振荡比生长速率的适配补料策略。 如图4(A)所示，对余弦函数进行调整，实现生长阶段与饥饿 分泌阶段的精确配比：生长阶段1.5 h，最大比生长速率0.3 h⁻¹，随后为0.5 h饥饿阶段。
该策略成功落地于工艺过程，实测溶氧浓度、BlueSens®尾气分析（O₂、CO₂）得到的CER、OUR曲线均可佐证（图4(B)）。 图4(C)表明，实测细胞干重(CDW)与基于CER在线估算的数据高度吻合。依托该工艺数据，完成补料曲线的适配（图4(D)），实现生长阶段与饥饿 ABF分泌阶段稳定、自动化控制。 本工艺采用碳源限制补料策略，避免底物过量补加，测得的果糖（主碳源）与乙酸（溢流代谢物）浓度均处于极低水平。
图4：巨大芽孢杆菌YYBm1（EJBmD1.3scFv）μ振荡补料分批工艺的过程控制；振荡补料分批过程中各过程控制变量总览
(A)μset与μset-0.25由余弦函数给定，设定最大比生长速率μmax=0.3。(B)在线测定溶氧(DO)浓度、计算得到摄氧率OUR与二氧化碳释放速率CER；生长阶段与饥饿阶段呈现清晰变化趋势。(C)生物量由μset-0.25与CER计算得到，并与实测生物量浓度比对。(D)补料速率完成适配，作为生长、饥饿各阶段的直接控制参数。(E)补料分批过程中总生物量与ABF绝对产量；灰色箭头代表生物量快速积累主要区间，红色箭头代表ABF分泌主要区间。
进一步观察振荡补料分批过程总生物量与ABF产量，可观察到明确的对应关系（图4E）：生物量主要在生长阶段稳步提升；ABF分泌则大多在受控饥饿阶段显著增强（图4E箭头标注）。与同等生物量浓度的普通分批工艺对比，单位克生物量的ABF滴度提升7倍[4]（原文未展示对应数据）。
4.3 单细胞分析
本培养过程还评估了细胞膜极化状态(MP)，采用已建立的DiOC_2荧光标记检测方法[4]。图5直观展示特定生长阶段下单细胞层面反复出现的极化与去极化过程。饥饿阶段细胞去极化程度显著上升，且与ABF分泌能力提升存在相关性。
图5：μ振荡补料分批工艺下细胞膜电位(MP)检测。 对处于指数生长期、稳定期不同培养时间点，分泌ABF D1.3 scFv的巨大芽孢杆菌YYBm1（EJBmD1.3scFv）开展单细胞膜电位分析。培养同步取样，经mathrmDiOC_2染色后流式细胞仪检测。散点图为单细胞红、绿荧光信号；红色荧光越强，代表细胞膜极化程度越高。箭头表示细胞反复由极化状态切换至去极化状态。
5 结论
本生物工艺同时实现ABF D1.3 scFv的菌体合成与产物分泌。分泌型产物的突出优势：目标蛋白在上清液中已正确折叠，杂蛋白杂质少，大幅降低下游纯化压力。下游处理成本可占到现代生产总成本的80%，该优势不可忽视[10]。 分泌型工艺对环境条件敏感，受比生长速率等多种参数影响[11]。本文开发一套工艺策略，利用稳定/饥饿阶段强化ABF D1.3 scFv分泌；通过适配的在线补料曲线，成功实现生长阶段与饥饿ABF分泌阶段交替运行。 本控制算法依托CER在线估算生物量浓度、培养体积，输出补料曲线，保证全流程生长、饥饿分泌阶段稳定可控。
该μ振荡补料分批工艺先在实验室规模完成验证，并已成功放大至中试装置（数据未展示）。向100 L生物反应器放大时，需要预先调整多项参数：尽可能增加生长饥饿循环次数；同时保证尾气CO2信号变化足够明显，确保补料启动时刻生物量估算精度。CER这类用于生物量估算的控制参数不具备规模依赖性，可保障全尺度工艺稳定。只要配备尾气分析设备与适配泵系统，该方法可以迁移至任意规模，也可用于其他分泌型产物的过程控制。
本研究采用随时间变化的余弦型μ振荡曲线；除此之外，还可实现其他曲线模式：比生长速率线性变化、调整μmax以延长生长或饥饿阶段。尤其在系统生物学准稳态比生长速率相关研究中，随时间线性变化的比生长速率方案，更适合可靠的过程控制。
综上，本研究建立一套稳健的微生物ABF分泌优化工艺。面对医保体系成本压力、市场需求提升与全球行业竞争，开发巨大芽孢杆菌这类低成本生产平台具备现实意义。 本研究表明：仅依靠菌种基因改造远远不够，还需要合理、完善的生物过程控制与工艺设计，才能搭建稳定可工业化放大的生产体系。 正如FDA倡导的过程分析技术(PAT)理念，生物量在线估算、单细胞水平检测等关键变量的测定，有助于深度理解生物过程内在机理。
参考文献
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该研究小组的核心研究方向是以**巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）**为表达宿主，实现抗体片段生产的全流程工艺优化。该研究隶属于德国合作研究中心SFB 578项目：《整合遗传学与工程学方法开发生物技术工艺——从基因到产物》。 该项目融合基础科学与基础工程科学手段，开发面向高附加值产物的优化生物工艺。革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌具备分泌能力强、质粒稳定性好的特点，被用作抗体片段生产的宿主。
生物工艺工程采用整体性研究思路，涵盖培养基优化、单细胞水平的过程监测，以及结合各类组学技术的整合系统生物学分析。研究旨在挖掘分泌环节潜在的限速瓶颈，以此为基础开展理性菌株改造与工艺设计，将巨大芽孢杆菌打造为适用于多种抗体片段的工业化生产平台。
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