人瘦素超敏检测试剂盒（日本IBL）

简介

1950年发现隐性肥胖基因突变导致肥胖，且与二型糖尿病综合征的病态肥胖类似。1994年在洛克菲勒大学团队发现肥胖基因编码形成瘦素。瘦素是由肥胖基因产生的16KDa的分泌型蛋白。脂肪组织产生瘦素并释放至血液中，随着脂肪的累积，血液中瘦素的水平含量也呈增长趋势。瘦素作为lipostat，随着脂肪组织内脂肪的沉积而增加；它还可作为一激素，指令大脑终止食物的消化和增加活动；还证明了可用于标记和控制青春期的开始；另外，近期研究表明，瘦素可通过中枢神经系统抑制骨形成。

测定意义

此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒，使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂，zui终溶液所显示的颜色强度与样品中瘦素的量成正比。检测范围15.63~1000pg/mL，此试剂盒用于人血清，EDTA-血浆和细胞上清中瘦素的定量检测。重组的和天然的瘦素都可用此试剂盒检测。

主要配件

1. 微孔板，96T，包被有抗人瘦素兔子IgG抗体，亲和纯化

2. 标记抗体浓缩，30X，0.4ml，HRP标记的抗人瘦素兔IgG Fab片段

3. 标准品，0.5ml，2支，重组人瘦素

4. EIA缓冲液，30ml，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS

5. 标记抗体稀释液，12ml，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS

6. 着色剂，TMB，15ml

7. 终止液，1N硫酸，12ml

8. 洗涤缓冲浓缩液，40X，50ml，0.005%吐温20的磷酸缓冲液

人瘦素超敏酶免试剂盒（日本IBL）准备步骤

试验所需材料但试剂盒未提供

• 酶标仪（450nm）

• 带刻度的量筒与烧杯

• 孵箱（37℃±1℃）

• 吸水纸

• 稀释试管

• 微量移液器和取样吸头

• 去离子水

• 坐标纸（log/log）

• 用于稀释标准品的试管

• 洗涤瓶

注意事项

1. 试验样品采集后应立即检测或是冻存，冻存的样品避免反复冻融，检测前应在低温下先将其*溶解混匀

2. 试验样品用EIA缓冲液稀释

3. 试验样品和标准品应做双份检测

4. 试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响检测

5. 只能用试剂盒提供的洗涤液洗板，否则会导致试验失败

6. 吸水纸上拍干微孔板，不能擦拭

7. TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属

8. 加入终止液后30min内必须酶标仪读数

检测流程

人瘦素超敏检测试剂盒（日本IBL）在实验前将所有试剂和试验所需板条平衡至室温。

标准品

加0.5ml的去离子水至标准品试剂瓶内，，静置10分钟，使用前混匀。

注意：配制的标准品在2~8℃下可保存6周，需保存更长时间需在-20℃下冻存。

质控品

加0.5ml的去离子水至质控品试剂瓶内，，静置10分钟，使用前混匀。

注意：配制的标准品在2~8℃下可保存6周，需保存更长时间需在-20℃下冻存。

洗涤液

30ml的浓缩洗涤液+1170ml的去离子水混合，得到1200ml的即用型洗涤液；稀释的洗涤液可在室温下保存2周。

检测步骤

每次实验都要建立标准曲线。

1) 将实验所需板条固定于板架上。

2) 加15ul的标准品，质控品和样本于相应的孔内。

3) 每孔加100ul的分析缓冲液；充分混合10秒，此步中完全混合很重要。

4) 室温下，不盖板，温育120min。

5) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

注意：试验灵敏度和精确度与洗板准确与否相关。

6) 每孔加100ul的抗血清。

7) 室温下温育30min。

8) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

9) 每孔加100ul的酶联混合物。

10) 室温下温育30min。

11) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

12) 每孔加100ul的底物液。

13) 室温下温育15min。

14) 每孔加50ul的终止液。

15) 加入终止液10min内在酶标仪450±10nm处读数。

结果计算

绘制曲线前，所有的数据都应减去试验样品空白值，包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度

附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果