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公司新闻
信帆生物为您提供：做PCR实验时候RNA 提取方法
点击次数：1213发布时间：2018/6/12 15:17:38
信帆生物为您提供：做PCR实验时候RNA 提取方法，上海信帆生物提供PCR实验代测，实时荧光定量PCR实验代测，RT-PCR代测。客户只需要提供样本，其他所有试剂都由本公司提供。一般7-10天出结果，提供原始数据，分析数据，实验报告，实验室所用仪器型号，图片，动力扩增曲线等。欢迎来电！
今天信帆生物带您了解RNA 提取方法
使用试剂：RnaExTM Total RNA Isolation Solution
1. 准备分离 RNA 的样品
a. 动物、植物组织
动物（5-20 mg）或植物（50-100 mg）组织样本需要 0.3 ml 的 RnaExTM 试 剂，使用组织捣碎机破碎细胞 5-20 s（2-3 次），加入 0.7 ml 的 RnaExTM 试剂， 颠倒混匀，室温裂解 5 min。
均质时样本体积不应超过 RnaExTM 试剂体积的 10％，切忌样品过多，过 多的样品容易造成裂解不完全，对提取 RNA 的质量影响极。
信帆生物为您提供：做PCR实验时候RNA 提取方法
b. 单层细胞
直接在培养皿中裂解细胞，3.5 cm 直径的皿中加入 RnaExTM 试剂 1ml，并 通过抽吸几次促进细胞裂解。RnaExTM 试剂的添加量基于培养的面积而不是细 胞的数目（每 10cm2 加入 1ml）。RnaExTM 试剂量不足可能会导致分离出的 RNA 有 DNA 的污染。
c. 悬浮细胞
离心沉淀细胞，在 RnaExTM 试剂中反复吹打以裂解细胞。1ml 试剂用于
5-10×106 的动物、植物或酵母细胞。
d. 细菌
冻存菌种划线，挑单克隆过夜摇菌，早晨继代一次，1:100 或 1:50 加过夜 菌，摇 2-3h，至 OD 为 0.6-0.8 左右，也可直接用过夜菌提取 RNA。取 1ml 菌
液离心，用 Tri（sPH 8.0）洗 2 次，培养基对 RNA 提取有影响。加入 1 ml RnaExTM，
剧烈混匀，室温裂解 5 min，使核蛋白复合物完全解离。
2. 加入 0.2 ml 氯仿，漩涡振荡，混匀样品，室温静置 2 min（开始分层）。12000 rpm、4 ℃离心 10 min。放置 EP 管时，方向必须一致。
离心后，混合物分离为红色下层（酚-氯仿相）、中间相以及上层的无色 水相。RNA 存在于水相，水相体积约为 60％均质时使用的 RnaExTM 试剂量。
信帆生物为您提供：做PCR实验时候RNA 提取方法
以上步骤需要剧烈振荡，保证充分混匀，不会对 RNA 产生损伤。
以下步骤需小心，不能剧烈振荡。 过柱法：
3. 取 400μl 上清（黄枪头吸两次）到无菌无酶的 1.5ml EP 管中，按 2:1 的比例 加入 200μl 无水乙醇，充分混匀，将上述溶液全部转移到套放于 2 ml 收集管内 的吸附柱中。8000 rpm、4℃离心 1min，除去收集管中的废液。
4. 加入 500 μl Buffer RWA，12000 rpm、4℃离心 1min，除去收集管中的废液。
5. 重复步骤 4 一次。
6. 12000 rpm、4℃离心 1min，除去收集管，将柱子放入无菌无酶的 1.5 ml 离 心管中，晾干 2 min，在柱内膜的中央小心加入 50 μl DEPC 水溶解 RNA，室 温 2 min。
7. 12000 rpm、4℃离心 1 min，收集 RNA，测定 OD 值，电泳检测，反转录或 放在-20℃保存。
沉淀法：
3. 取 400μl 上清到无菌无酶的 1.5ml EP 管中，按 1:1 的比例加入 400 μl 异丙醇， 充分混匀，-20℃放置 20 min。
4. 12000 rpm、4℃离心 10 min，小心弃去上清。
5. 加入 1 ml 75%乙醇，上下颠倒混匀，12000 rpm、4℃离心 5 min，小心弃去 上清。
6. 加入 1 ml 75%乙醇，上下颠倒混匀，12000 rpm、4℃离心 5 min，小心倒去 上清，12000 rpm、4℃离心 1 min，用黄枪头吸取残留的液体，切勿接触沉淀。 7. 开盖晾干 3 min，让残存的乙醇挥发殆尽，加 50 μl DEPC 水用手指轻弹管 低溶解 RNA，室温放置 10 min，测定 OD 值，电泳检测，反转录或放在-20℃ 保存。
对于样品量较少的情况（植物样品低于 20mg，动物样品低于 5mg），建 议使用沉淀法，但是沉淀法 DNA 和蛋白质污染较过柱法严重。对于样品量足 够的情况，建议使用过柱法，过柱法提取的样品 DNA 和蛋白质污染较少，样 品损失与沉淀法相比较。细胞和 miRNA 全部使用沉淀法。
信帆生物为您提供：做PCR实验时候RNA 提取方法,如果您有实时荧光定量PCR方面的问题，欢迎联系上海信帆生物科技有限公司。
