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信帆生物：MMP2，MMP9明胶酶谱法试剂盒操作步骤
点击次数：4019 发布时间：2016/7/4 10:36:43
信帆生物：MMP2，MMP9明胶酶谱法试剂盒操作步骤！
检测步骤：
1.制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 TEMED，等待凝胶聚合。
2.待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer （用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue），混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染 Marker 即可。阳 性对照（可选步骤）：可取人、小鼠、鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。
3.低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4.洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入 10 ml1× Buffer A（用蒸馏水稀释），室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。
5. 孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B（蒸馏水稀释），室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。
6. 显色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的部分区域被深染，在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的小位置（酶谱）及 活性。阳 性对照将在 66~72 （MMP-2）、92 （MMP-9）、130 （proMMP-9）、225 （proMMP-9） kDa 位置出现透 明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑 色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中常见的格式。
原创作者：上海信帆生物科技有限公司
