奶粉中的维生素A、D3、E的测定固相萃取-高效液相色谱法-分析方法-技术文章-济南赛畅科学仪器有限公司

奶粉中的维生素A、D3、E的测定固相萃取-高效液相色谱法

发布时间：2014/4/6 10:29:41关注度：5286

目前对奶粉中脂溶性维生素A、D3、E测定的前处理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化过程后使用大量的有机溶剂进行液液萃取以洗除杂质，操作步骤复杂，维生素D3样品还需经硅胶柱做进一步的净化才能进行检测，造成实验时间成本的增加，不利于大批量样品的检测。本文研究了利用固相萃取法作为奶粉样品的前处理方法，高效液相色谱法作为检测手段，实现同时测定奶粉中维生素A、D3、E的含量，该方法可简化奶粉样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。

1. 样品处理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混匀，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁处理，混匀，加入10mL氢氧化钾碱液（1.25g/mL），55℃条件下，水浴皂化45min，取出冷却至室温，向皂化液中加入适量无水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min离心5min后，取上清液，用1至2个微孔过滤器对其进行过滤，至Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪上样管中作为待净化液。

2. 固相萃取净化

Qdaura^TM卓睿全自动固相萃取仪程序设定：5mL甲醇，和5mL水活化，加样，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脱，收集。收集液于40℃氮气吹干，1mL甲醇定容，0.45um PTFE过滤器过滤，准备进液相色谱分析。

3. 色谱条件

高效液相色谱仪：LC-10F

色谱柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流动相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20µL；

波长变化见表1：

表1 波长变化梯度表

组分	时间/min	波长/nm
维生素A	0	325
维生素D3	5	264
维生素E	9	294

4. 结果与讨论

图1 低浓度维生素标准溶液的色谱图

从左至右依次为：维生素A（5.0µg/mL）、维生素D3（9.8µg/mL）、维生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲线及检出限

根据仪器对各个物质的响应情况，将维生素A、D3、E分别由储备液用正己烷逐级稀释，各稀释成7个浓度，维生素A浓度范围为0.25µg/mL~25µg/mL，维生素D3浓度范围为0.30µg/mL~30µg/mL，维生素E浓度范围为2.5µg/mL~250µg/mL，将溶液进HPLC进行检测，计算出检出限，回归方程及检出限见表2。可见，液相色谱仪对维生素A、D3、E的响应与浓度呈良好的线性关系。

表2 线性回归方程及检出限

化合物	回归方程	相关系数	检出限 LOD* （µg/mL）
维生素A	y=55.572*x-1.517	1	0.02
维生素D3	y=57.608*x-1.9814	1	0.05
维生素E	y=8.1342*x-1.9094	1	0.39

图2 皂化-固相萃取法色谱图

4.2 皂化-固相萃取和传统皂化-液液萃取法的实验效果对比

传统皂化-液液萃取法参考《GB 5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定》的样品前处理2个奶粉（每个样称取2g）的平行样，作为参照。同时以皂化固相萃取法做两个平行样品。

表3 传统皂化-液液萃取法与皂化固相萃取法的实验结果对比

	维生素A峰面积	维生素D峰面积	维生素E峰面积
传统皂化-液液萃取法	778	0	148
皂化固相萃取法	1500	0	716

由于选用的奶粉VD含量较低，没有检出。

从上述对比可以看出，皂化固相萃取法相比国标的皂化液液萃取法具有简单高效的优势，同时萃取效果更好。唯一的缺点是出峰靠前的维生素A附近有较多的弱保留物质的干扰，但是依靠MP C18的强大的分离能力，可以实现分离维生素A和干扰物质的基线分离。同时这些弱保留的物质很容易被洗脱出色谱柱，所以不会对色谱柱造成较大的污染。

4.2.3加标回收率实验

表4 加标回收率及精密度

	化合物	样1（%）	样2（%）	样3（%）	样4（%）	样5（%）	平均回收率%	RSD（%，n=5）
低浓度加标	维生素A	89.91	91.48	86.12	89.59	90.12	89.44	2.33
	维生D3	112.36	114.63	106.34	111.63	105.35	110.06	3.83
	维生素E	85.58	86.87	81.83	85.64	84.56	84.90	2.86
高浓度加标	维生素A	88.84	91.48	89.61	86.43	89.57	89.18	2.04
	维生D3	93.06	94.65	93.19	90.38	92.86	92.83	1.66
	维生素E	86.68	87.62	87.00	83.25	85.94	86.10	1.98

4.2.3 实际样品检测

根据所建立的方法分析了从市场上购买的3种品牌奶粉，分别编号为1号、2号和3号按照上述方法进行样品处理和检测，所得维生素A、D3和E的含量结果见表6。

图7. 2号奶粉样品色谱图

表6 奶粉中维生素含量（µg/g）

化合物	1号（µg/g）	2号（µg/g）	3号（µg/g）
维生素A	6.008	42.5	165.0
维生素D3	0.392	0.000	0.463
维生素E	5.712	6.231	9.344

4.3 结论

采用改进后的皂化-固相萃取方法来替代传统的皂化法来测定奶粉中维生素含量，皂化能充分提取出奶粉中维生素A，D，E，再经过Cleanert Vitamin固相萃取柱进行净化吸附洗脱，既避免了传统皂化中液液萃取中有机溶剂的大量使用，也简化了操作步骤，同时能满足一般奶粉样品的含量分析要求。

5.订货信息

产品名称	规格包装	订货号
LC-10F高效液相色谱仪	10ml/min，梯度系统，200-800nm双波长检测器	FL-LC010GS
LC-10F高效液相色谱仪	配紫外可变波长检测器	LC-10F
CC-100分析型色谱柱温箱	温控范围：5-70℃；可安装1-2支300mm色谱柱	CC-100
Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪	4通道24位	SPE-40
Cleanert Vitamin脂溶性维生素专用萃取柱	1g/12mL , 20支/pk	V00012
Venusil MP C18液相色谱柱	4.6 mm x150 mm，5µm	V952505-0
微孔过滤膜（PTFE疏水）-双膜	045µm,直径13mm,100/pk	AS041345-P
微孔过滤膜（PVDF亲水）-双膜	0.45µm,直径13mm,100/pk	AS073345-G
一次性无菌注射器	5mL, 100/pk	ZSQ-5ML
1.5mL样品瓶	100/pk	1109-0519
1.5mL样品瓶盖	100/pk	0915-1819
甲醇	4×4L/瓶	AH230-4
乙醇	4×4L/箱	AH090-4
乙酸乙酯	4×4L/箱	AH100-4
正己烷	4×4L/箱	AH216-4

原创作者：济南赛畅科学仪器有限公司

关键字：净化

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