上海劲马TUNEL技术服务主要内容
发布时间：2015/5/6 8:48:53关注度：208
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提供者
上海elisa生物技术有限公司
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资料大小
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发布时间
2015/5/6 8:48:53
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资料类型
doc
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关注度
208次
上海劲马TUNEL技术服务主要内容包括：
一、服务项目简介
TUNEL细胞凋亡检测(TUNEL Apoptosis Assay)是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。 基因组DNA断裂时，暴露的3＇-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin 结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
二、技术步骤
1.材料与试剂(以Promega试剂盒为例)，包括：
①生物素标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/μL
②TdT酶(25U/μL)
③反应缓冲液
④洗涤缓冲液
⑤异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗体(1：30)
⑥PI染液(含PI 5μg/mL及无DNA酶活性的RNA酶0.1%)
⑦PBS缓冲液
⑧塑料盖玻片
2.样品
①悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
②贴壁生长的培养细胞
③冰冻切片
④常规石蜡切片
3.操作方法
①固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h(-20℃)。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。
②洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次。
③反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加反应液(每50μL反应液含TdT酶0.5μL,标记的-dUTP 1μL)，使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。
④终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。
⑤FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液(含FITC 2.5μg/mL)，室温下避光孵育10min。
⑥洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
⑦PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。
⑧封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。
4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光(波长488nm)，所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。
三、应用领域
细胞凋亡(apoptosis)的分析方法，细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA段的产生。
四、服务周期
1.交货时间： 15~20天
客户须知(对材料的要求、注意事项)
2.结果提供：正常和阳性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告；
3.样本要求：取材保持组织新鲜(组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜(，立即放入固定液中(固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液，体积为组织块的10倍以上)，避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。
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