ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。

从单细胞水平观察分泌蛋白的表达已成为目前研究细胞功能的重要内容，酶联免疫斑点法(ELISpot)技术巧妙地运用了酶联免疫吸附技术，从方法上解决了该难题，已广泛运用于各项重要课题研究中。ELISpot最初用于检测分泌抗原特异性抗体的个体B细胞，以后该方法不断改进，用于检测分泌特定抗原的单个细胞。

实验方法原理：ELISPOT技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

实验材料：

1.细胞

2.70％乙醇 、PBS、 脱脂奶粉 、链霉亲和素 、检测抗体、 包被抗体

3.PVDF膜、 96孔培养板 、硝基纤维素底板、 免疫斑点板、 酶标板

实验步骤：

一、包被96孔板

用70％乙醇浸润96孔板中的PVDF膜30 s

加入捕获抗体（PBS稀释），4℃过夜

倒空板中包被液，轻轻在纸上拍干，用PBS洗涤，禁用洗板机

加入100ul 2%的脱脂奶粉（或者BSA）室温孵育2小时，封闭板中空白位点

PBS洗涤1次。（如果暂时不用，可将96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）

二、细胞刺激和细胞因子捕获

从新鲜血液中用Ficoll分离PBMC并进行计后，将细胞用培养液稀释后加入96孔板中。细胞数量需要优化，进行备比稀释以确定合适的细胞数量。通常所用细胞数量为1-2×105/孔。

将96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育过夜。禁止移动或晃动板子。

用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分钟，去除细胞和未结合的细胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗涤3次。 禁用洗板机。

三、加入检测抗体检测

加入标记的检测抗体（用含1％BSA的PBS稀释），室温孵育1-2小时。

加入底物显色（如果检测抗体为酶标）或者荧光直接检测（如果检测抗体是荧光标记）：在加入底物之前用蒸馏水洗涤板子膜的两侧，以防止部分溶液漏出后导致的背景。监测斑点的形成，适时终止反应。

用蒸馏水洗涤终止反应。

四、结果分析

将96孔板干燥。（将板子放在4℃避光过夜，可使斑点边缘锐化，更易分辨）

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原创作者：上海劲马生物科技有限公司