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影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

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上传时间：2013/6/20 9:37:52

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上传者：北京方程生物科技有限公司

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影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。

操作步骤

可能原因

解决办法

选择试剂

选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

加样

1.血清或血浆标本分离不好即进行加样；

2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）；

3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。

2.加样后及时放入孵箱。

3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。

5.标本较多时，请分批操作。

孵育

1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；

2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

1.贴封片或加盖；

2.按说明步骤严格控制操作时间。

洗板

1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。

2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。

3.反应板过多造成洗板等待时间长。

1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；

2.合理安排，或多用几台洗板机。

显色

1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；

2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。

1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；

2. 加样时保持显色剂不外流；

3.A、B液应避免接触金属器械。

终止

加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。

加终止液时应避免产生气泡。

读板

读板时板底不清洁。

应保证酶标板清洁。

全过程

1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;

2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。

影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。

ELISA技术讲座一-抗原与抗体的反应

1.2　抗体

1.2.1　抗体的结构

抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。IgG的结构见图。