上海恒远为您解析如何确定ELISA抗原和抗体的稀释倍数_解决方案_技术文章

在运用ELISA方法测定抗体方面，通常所用的方法称为间接法，也是目常用的方法，其原理：间接法先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM)，再经孵育洗涤后，加底物显色,底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定。

操作步骤：

1.将抗原按5 μg/ml稀释于碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，100 μl /孔，4℃过夜。

2.次日PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

3.加2％BSA封闭室温1 h，200 μl /孔。

4.阳性对照从10ug/ml，做倍必稀释，待测血清从1：50做倍比稀释，预试验后确定稀释倍数及阳性对照的起始浓度及稀释数量（以可以做标准曲线为参数），室温1h。

5.PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

6.加入1：3000（不同公司有不同的推荐稀释度） PBS－T稀释的HRP标记的山羊抗人IgG，100 μl /孔，室温1h。

7.PBS－T清洗4次(快1慢3，间隔5分钟)。

8.显色，100 μl /孔，颜色变深后中止显色，2M硫酸在BIO－RAD酶标仪上读数，可用ABTS，OPD，TMB等

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