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“ELISA试剂盒”常见的问题及解答

点击次数：4131 发布时间：2013/7/31 9:01:28

“elisa试剂盒”常见的问题及解答
问：抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？
答：a）抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b）蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等
问：蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？
答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。
问：磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
问：要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
问：做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
问：细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？
答：一般5×10^6就足够了
问：同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？
答：能，没有问题。
问：同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
问：如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
问：我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。

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