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技术文章

你们了解双抗夹心ELISA法吗?

点击次数:3458 发布时间:2022/10/10 9:55:52

双抗夹心ELISA法是指讲特异性针对代测抗原的抗体包被于96孔微孔板中,制成固体载体,向微孔中分别加入标准品或标本,其中代测抗原连接于固相载体的抗体结合,然后加入生物素化的针对代测抗原的抗体,形成夹心,将未结合的生物素化抗体洗净后,加入HRP标记的亲和素,再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下,转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测抗体原正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值),用于样本中待测抗原浓度测算。
1.材料与仪器
(1) 包被缓冲液 (pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液)
(2)洗涤缓冲液 (pH 7.4,0.15 M PBS)
(3)稀释液
(4)终止液(2 M H2SO4)
(5)底物缓冲液 (pH 5.0)
(6)四甲基联苯胺(TMB)使用液
(7)2,2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液
(8)抗原、抗体和酶标记抗体:按说明书处理。
(9)标准品:用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
(10)96 孔聚苯乙烯塑料板 (酶标板)。
2.步骤
⑴将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。
⑵加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
⑶加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
⑷加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

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