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同位素法测定底物磷酸化活性方法
点击次数：1954发布时间：2012/9/27 13:48:11
磷酸化的底物
史葛·艾伯林，N维库马尔，和迈克尔J韦伯
微生物学系和癌症中心，弗吉尼亚大学卫生系统，夏洛茨维尔，弗吉尼亚州22908
摘自蛋白质：蛋白质相互作用，第二版
编辑golemis和彼得·亚当斯·A。
摘要
理想的情况下，人们希望能够直接磷酸化的基板在一个完整的细胞。这可能是通过引入到居住或透细胞三磷酸腺苷的模拟。然而，细胞是不透水的三磷酸腺苷，并增加标记的三磷酸腺苷模拟毛地黄皂苷-透细胞结果的水解三磷酸腺苷的模拟1分钟内（乔杜里等人。2002。因此，我们选择了应用此技术的细胞裂解物或分数。在这里，我们描述的方法直接检测基板的蛋白质激酶。第一种办法涉及确定激酶基板immunoprecipitating标签的形式突变激酶转染COS - 1细胞，并执行一个激酶反应增加γ- [标记]三磷酸腺苷的模拟。第二中方法涉及除重组突变激酶和γ- [标记]三磷酸腺苷模拟细胞裂解液。我们使用这些技术的磷酸化ERK 2基板；然而，这种方法可以适用于其他蛋白激酶。
材料（方法Ⅰ和Ⅱ，如上）
缓冲器，解决方案，和试剂
重组激酶（Ⅱ）
[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模拟（Ⅰ+Ⅱ）
时凝胶琼脂糖珠（我）
脂质体转染（我）
激动剂（我），例如，表皮生长因子，血清，血小板衍生生长因子
国旗平方米琼脂糖珠（我）
十二烷基硫酸钠，20%（我）
平方米裂解缓冲液（二）（见议定书1）
公共电视网，室温（我）和冰冷的（Ⅰ+Ⅱ）（见议定书1）
无血清培养基（我，例如，贝科的介质）
旗肽（5毫克/毫升的低渗裂解缓冲液）（我）
激酶缓冲区含有脒，10毫米和100毫米氯化钠（二）
2 Laemm li样品缓冲（我）
低渗裂解缓冲液（我）
20毫米复（7.4）
2毫米钙
2毫米氯化镁
细胞的
1细胞（Ⅰ+Ⅱ）
质粒
maxi-prep DNA质粒携带的抗原表位标记版本的野生型和突变形式的激酶的兴趣（我）
特殊设备
组织培养皿（Ⅰ+Ⅱ）
皮下注射针头的1 / 4，1 ＇，27计（我）
提取柱（我）
透析盒，10000分子量截止（Ⅱ）
SDS -聚丙烯酰胺凝胶（我）
旋转，设置在冷藏室（4°丙）（我）
沸水浴，预设100°丙（我）
孵化器，预设37°℃，5%二氧化碳（Ⅰ+Ⅱ）
孵化器，预设30°丙（Ⅰ+Ⅱ）
离心冷却到4摄氏°（Ⅰ+Ⅱ）
方法
方法：磷酸化激酶底物
重要的是规范的程序在小型反应之前，扩大程序识别新型基板。
1×106到100毫米1细胞组织培养菜的前1天转染。培养细胞在37摄氏°5%二氧化碳。转染的细胞与6µ克质粒携带抗原表位标记版本的野生型或突变形式的激酶的兴趣，和24µ升的脂质体转染，根据制造商的指示。
24至72小时posttransfection洗两次，细胞与室温硫化铅和serum-starve他们在无血清培养基的4 - 12小时。然后，刺激细胞激动剂5 - 10分钟。
这取决于激酶正在研究，不同饥饿时间和兴奋剂可以用。
洗细胞两次冷硫化铅冰。添加低渗裂解缓冲液（0.5毫升/ 100毫米菜）。
低渗裂解缓冲区是用来保护蛋白相互作用与相关蛋白。为确定相互作用基板，形成稳定的协会，平方米裂解缓冲液（见议定书1）或另一个缓冲区与浓度的增加洗涤剂或盐可以用来（哈洛和1999巷）。
刮的细胞一起和他们转移到1.5毫升微量管。不要涡。溶解细胞的15000g在微量离心在20分钟在4°C
转移上清（~ 1毫克蛋白）为新管。保持小等分旁白（20µ克）检查的表达水平的蛋白表达。
洗时凝胶适量的琼脂糖珠（30µ升/样本）与低渗缓冲液和混合flag-m2琼脂糖珠（10µ升/样本），或珠共轭抗体表位标记的另一个选择（~ 1µ克抗体每1毫克的蛋白质裂解液）。
洗混合珠两次在低渗裂解缓冲液，然后将它们添加到裂解制备步骤5（40µ我每样本）免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小时在4摄氏°不断旋转。
洗三次免疫沉淀与低渗裂解缓冲液（1毫升每洗每个样品）。决赛后的清洗，吸剩下的几滴缓冲使用1个1 / 4英寸，27衡量针。
执行激酶反应总体积
