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RT-PCR实验步骤

点击次数:1763发布时间:2012/9/19 8:33:45

 

一、组织抽提:
1.       取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2.       移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3.       移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4.       冰上孵育5分钟
5.       离心12,000g 4℃ 5分钟取上清液移入1.5ml新离心管
6.       加0.2 ml氯仿,震荡,冰上孵育5分钟
7.       离心<12,000g 4℃ 10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管
8.       加0.5 ml异丙醇,震荡,冰上孵育5分钟
9.       离心<12,000g 4℃ 5分钟弃去上清液
10.   加入1 ml 75%乙醇,震荡
11.   离心<7,500g 4℃ 5分钟弃去上清液
12.   室温下使之变透明
13.   加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA(可保存在液氮或低温冰箱)
14.   走RNA变性电泳观察18s,28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度
 
 
 
 
二、RT反应体系(第一步):约20分钟

RNA    抽提物
5μl
Radome引物
2μl
RNA sin
0.5μl

1.       65℃ 15分钟
2.       立即放入冰浴
RT反应体系(第二步):约2小时

RNA sin
0.5μl
10mM  dNTP
1μl
5×RT 缓冲液
4μl
25mM MgCl2
4μl
AMV 逆转录酶
3μl

1.       37℃ 1.5小时
2.       94℃ 5-10分钟
3.       反应物保存于-20℃或进行PCR
三1、PCR反应体系:约4.5小时

25mM MgCl2
2μl
10×PCR 缓冲液
5μl
10mM  dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
2.5μl
ddH2O
34μl
Taq酶
0.5μl
轻质石蜡油
50μl
 
100μl

1.       94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟为第一个步1个循环
2.       94℃ 45秒,55℃ 40秒,72℃ 1分钟为第二步30个循环
3.       72℃ 10分钟
4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
三2、PCR反应体系:约5小时

25mM MgCl2
3μl
10×PCR 缓冲液
5μl
10mM  dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
5μl
ddH2O
30μl
Taq酶
1μl
轻质石蜡油
50μl
 
100μl

1.       94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟为第一个步1个循环
2.       94℃ 45秒,50℃ 40秒,72℃ 1分钟为第二步40个循环
3.       72℃ 10分钟
4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
四、电泳:约1.25小时
1.       配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml
2.       胶浓度1.7%(40ml 0.5×TBE加0.68g胶)
3.       微波炉中火2分钟溶解胶
4.       冷却至60℃加入溴乙锭2μl(10mg/ml的终浓度0.5μg/ml)
5.       放入梳子,浇板,待凝固
6.       加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰
7.       电泳50-80V(每㎝ 5V)

 

上海恒远生物科技有限公司主要经营的产品有elisa试剂盒,生物试剂,标准品,血清,抗体,培养基,细胞,欢迎各位前来咨询。

 

 

 

 

 

 

 

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