恒远生物|蛋白质相互作用_技术交流_技术文章

在bao证两种蛋白质相互作用的条件下，收集并裂解细胞。在细胞裂解液中加入某一种已知蛋白的特异性抗体，孵育后再加入可与特异性抗体结合的蛋白A/G-琼脂糖珠（或磁珠）沉淀收获抗原抗体复合物，若细胞中存在与已知蛋白结合的目标蛋白，则可被磁珠沉淀下俩，形成“目标蛋白-已知蛋白-抗已知蛋白抗体-磁珠”复合物。经SDS-PAGE后，复合物可被分离，再经免疫印迹或质谱鉴定出目标蛋白。

优势：

① 得到的蛋白质相互作用是在细胞内天然形成的，反映的是细胞的生理状态；

② 可以分离得到天然状态的蛋白质复合物。

劣势：

① 可能检测不到低亲和力的瞬时蛋白质-蛋白质相互作用；

② 不能证明两种蛋白质的直接结合，其他分子可能起到桥梁作用；

③ 依赖于高质量的、可用于免疫沉淀的特异性抗体。

不同类型的免疫共沉淀技术

1、二次免疫共沉淀技术：用来检测细胞内三种蛋白质间的相互作用，若要证明X、Y、Z三种蛋白质间是否以复合物形式存在，先在细胞裂解液中加入抗X蛋白质抗体，免疫沉淀获得抗原抗体复合物，经过非变性洗脱后，向此复合物溶液中加入抗蛋白质Y的抗体，再收集免疫复合物进行SDS-PAGE分析。

2、蛋白质降解抑制-免疫共沉淀：若两种蛋白质结合后，其中一种会降解，则会影响IP实验结果，故需要抑制细胞内蛋白质降解。

① 对于通过溶酶体途径降解的蛋白质，可以加入NH4Cl或氯喹改变细胞内酸性环境，抑制这类蛋白质降解。

② 对于通过泛素-蛋白酶体途径降解的蛋白质，可用MG132抑制，该试剂对细胞有毒性，故作用时间不能太久。

3、核质分离-免疫共沉淀：体内的许多蛋白质是在细胞质和细胞核之间穿梭的，研究时有时会出现时空问题。故先利用核质分离技术得到细胞核或细胞质完整的组分。

4、交联免疫共沉淀：能够使已经结合在一起的蛋白质更加稳定。避免结合能力弱或瞬时结合的蛋白质在实验过程中降解。

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