人细胞周期素D1（Cyclin-D1）免疫组化试剂盒实验操作步骤_技术交流_技术文章

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人细胞周期素D1（Cyclin-D1）免疫组化试剂盒实验操作步骤

点击次数：4041 发布时间：2015/9/11 9:23:26

人细胞周期素D1（Cyclin-D1）免疫组化试剂盒：
该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin Conjugate，
HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性Cyclin-D1 抗原。该试剂盒
具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的Cyclin-D1 一抗
与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入HRP-SA，形
成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。
人细胞周期素D1（Cyclin-D1）免疫组化试剂盒实验步骤（建议方案）：
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度
1.烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；
2.脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min；
4.抗原修复：根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温
度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×
2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，
直接进入第5 步封闭。
5.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜；
7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；
8.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min；
9.加二抗：滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育
30 min；
10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；
11.封闭：滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min；
12.加HRP-SA：滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），
37℃湿盒中孵育30 min；
13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；
14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色；
15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；
16.封片：待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
17.观察成像：显微镜下观察成像。

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