实验推荐——分子标记技术AFLP实验方法原理：
AFLP 是RFLP与PCR两种技术的优点相结合的产物，它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。
其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，然后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。
本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；
AFLP 技术被认为是一种十分理想、有效的分子标记。
实验材料：
1.1 样品保存与运输
| 样品类型 | 样品要求 |
| 植物材料 | 新鲜组织、叶片采用硅胶干燥后或干冰运输到实验室 |
| 动物材料 | 新鲜组织，无水乙醇封存低温运输到实验室 |
| DNA | 干冰运输到实验室 |
实验步骤：
1.2 DNA 提取（实验方法视DNA来源而异，此处以普通植物样本为例）
CTAB法提取
1） 称取材料50mg，液氮研磨三至四次
2） 将粉末放到装有800µl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中
3） 加入60µl巯基乙醇混匀，60度预热30min
4） 其间混匀二至三次取出样品于室温放置
5） 待样品冷却到室温加入800µl氯坊：异戊醇（24：1）
6） 振荡混匀，12000rpm离心15min
7） 取上清到一新2ml离心管，加入等体积的氯坊：异戊醇（24：1），振荡混匀，12000rpm离心15min
8） 取上清到一新2ml离心管中加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20-30min，12000rpm离心15min
9） 将沉淀晾干溶于200µl TE-buffer（溶解）
10） 加入400 µl 95% 乙醇，20µl 3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小时
11） 4℃ 离心，12000rpm离心15min
12） 500µl 75%乙醇洗涤，12000rpm离心10min
13） 加入30-50µl TE-buffer
14） 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测
备注：CTAB法主要针对植物基因组DNA的提取，其它样品：如动物组织、细胞、菌体等公司有相关试剂盒。
1.3 限制性酶切及连接反应
反应体系
| 组分 | 对照（体积） | 样品（体积） |
| DNA模板（50ng/μl） | 4μl | 4μl |
| Adapter | 1μl | 1μl |
| EcoR I/MseI | 2μl | 2μl |
| 10XReaction buffer | 2.5μl | 2.5μl |
| 10mM ATP | 2.5μl | 2.5μl |
| T4 Ligase | 1μl | 1μl |
| H2O | 7μl | 7μl |
混匀离心数秒 37℃保温5h ，8℃保温4h，4℃过夜。
-20℃保存，作为预扩增模板
1.4 预扩增
| 组分 | 体积 |
| DNA | 2μl |
| Pre-ampmix（预扩引物） | 1μl |
| dNTPs | 1μl |
| 10XPCR buffer | 2.5μl |
| Taq 酶 | 0.5μl |
| ddH2O | 18μl |
离心数秒,按下列参数进行PCR扩增
94℃ 2min
94℃ 30S
56℃ 30S， 30 cycles
72℃ 80S
72℃ 5min
4 ℃
1.5 选择性扩增
预扩产物1:20稀释后作为选扩模板
按以下体系混匀后，离心数秒
| 组分 | 体积 |
| 预扩稀释样品 | 2μl |
| 10XPCR buffer | 2.5μl |
| dNTP | 0.5μl |
| EcoRI 引物 | 1μl（共8种） |
| MseI 引物 | 1μl（共8种） |
| Taq 酶 | 0.5μl |
| ddH2O | 17.5μl |
| Total volum | 25μl |
按下列参数设置PCR循环
1） 一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S， 72℃ 80S
2） 以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。
3） 接着按下列参数扩增23轮
94℃ 30S，
55℃ 30S 23 Cycles
72℃ 80S
4) 72℃ 5min
5） 4 ℃
1.6实验结果
ABI377测序仪电泳检测。数据通过GENESCAN软件进分析。
电泳图谱
