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技术文章
显微镜下的“生死簿”:如何一眼看穿细胞死活? | 上海富衡
点击次数：1343 发布时间：2026/2/26 9:45:42
细胞实验的成败，往往始于对“生死”的判断。 在细胞培养的世界里，细胞的状态直接决定了实验的成败。无论是复苏、传代还是药物处理，我们都需要时间掌握细胞的“生死”情况。今天， 我们就来聊聊如何在显微镜下，快速、准确地判断细胞是“死”还是“活”。
在未染色的情况下，通过普通光学显微镜观察细胞形态，是判断细胞状态最直接、最快速的方法。虽然这种方法主观性较强，但经验丰富的实验者 往往能通过“印象“做出初步判断。
1.活细胞：生机勃勃的“小圆饼”
形态饱满： 活细胞通常呈圆形或椭圆形，形态规则，边缘清晰，像一个个饱满的小圆饼。
折光性强： 由于细胞膜完整且细胞质密度均匀，活细胞在显微镜下具有较强的折光性，看起来明亮、透亮。
贴壁良好： 对于贴壁细胞，活细胞会牢牢地“趴“在培养皿底部，形态舒展(如成纤维细胞呈梭形),细胞核清晰可见。
（RAW264.7货号：FH0328）
2.死细胞：黯淡无光的“残骸”
形态异常： 死细胞往往失去正常形态，可能变得皱缩、肿胀或破裂。
折光性弱： 死细胞的细胞膜通透性增加，内容物可能泄漏，导致折光性变差，看起来黯淡、发黑，甚至呈颗粒状。
漂浮或脱落： 死细胞无法正常贴壁，常漂浮在培养液中，或轻轻一吹打就从皿底脱落。
注意： 形态学观察虽然方便，但无法精确量化，且对于早期凋亡或状态不佳的细胞容易误判。因此，它通常作为初步筛查手段，更精确的判断还需 要依赖染色法。
台盼蓝染色是实验室最常用、最经济的细胞活性检测方法，原理简单，操作快捷。
1.核心原理：膜完整性是“生死线”
活细胞(拒染):活细胞的细胞膜结构完整，具有选择透过性，能够排斥台盼蓝染料进入。因此，在显微镜下，活细胞无色透明，保持原有形 态。
死细胞(吸染):死细胞的细胞膜完整性丧失，染料可以自由进入细胞内部，与细胞内容物(如DNA) 结合。因此，死细胞会被染成均匀的蓝 色。
2.操作要点与判读
混合：将细胞悬液与0.4%的台盼蓝染液按9:1或1:1比例混合，轻柔吹打混匀。
计时：室温孵育1-5分钟 (严格计时!时间过长活细胞也会被染色)。
观察：滴加至血细胞计数板，显微镜下观察。
活细胞：小而圆，无色透明，折光性强。
死细胞：体积可能稍大，深蓝色，无折光性。
（Hela细胞台盼蓝染色图片）
3.严谨的注意事项
时间窗口：染色时间必须严格控制。超过5分钟，活细胞可能因染料渗透或细胞损伤而开始着色，导致活率计算偏低。
区分碎片：视野中可能有一些不规则的蓝色小颗粒，这些是细胞碎片，不应计入死细胞总数。死细胞应是完整的圆形蓝色细胞。
血清干扰：染色前用PBS清洗细胞，去除残留的血清，因为血清中的蛋白可能与染料结合产生背景干扰。
当需要更高灵敏度或区分凋亡与坏死时，荧光染色法是更优的选择。它利用不同荧光染料对活死细胞的选择性结合，在荧光显微镜下呈现鲜明的颜 色对比。
1.钙黄绿素-AM (Calcein-AM)/碘化丙啶(PI) 双染法
这是目前最主流的荧光活死细胞检测方法，被誉为“准”。
活细胞(绿色): Calcein-AM本身不发荧光，但能自由穿透细胞膜进入活细胞。活细胞内的酯酶会将其水解成Calcein,后者不能穿透细胞膜而被 “锁”在细胞内，发出强绿色荧光。
死细胞(红色): PI是一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜。只有当细胞膜破损(死细胞)时， Pl才能进入细胞核与DNA结合，发出红色荧光。
结果判读：在荧光显微镜下，视野中绿色的是活细胞，红色的是死细胞，一目了然，且可以进行精确定量分析(如流式细胞术)。
（PBMC荧光染色图片）
2.其他荧光染料
·Hoechst/DAPI: 这两种染料主要与DNA 结合，发出蓝色荧光。它们通常用于标记细胞核。需要注意的是，它们能穿透所有细胞的膜，因此不能 单独用于区分死活，常与其他染料(如PI)联用，或在固定细胞后使用。
判断细胞死活，是细胞实验的基本功。在日常工作中，我们可以遵循以下流程：
1.步(粗筛):先用普通显微镜看形态，如果视野里细胞透亮、贴壁好，说明状态不错。
2.第二步(定量) :如果需要精确计算存活率(如冻存复苏后),使用台盼蓝染色，3分钟内完成计数。
3. 第三步(精研):如果研究细胞凋亡或需要高精度成像，使用Calcein-AM/PI双染，在荧光显微镜下获取最可靠的数据。
记住，无论哪种方法，严谨的操作 (如控制染色时间、轻柔吹打)和准确的判读 (区分死细胞与碎片)都是获得真实数据的关键。
原创作者：上海富衡生物科技有限公司
