现象：样品从100 μL加到200 μL，补足PBS，OD₅₉₅变化很小，不成比例升高。

👉核心判断：上清里有效可溶性蛋白很少，提取失败/蛋白被破坏，不是单纯稀释问题。

主要原因逐条

1. 蛋白发生降解（非常高频）

内源蛋白酶把可溶性蛋白水解成小肽；小肽几乎不和考马斯亮蓝G‑250结合，所以加再多上清，OD也上不去。

诱因：

• 研磨后回温，冰上放置时间太久；

• 离心不是4℃；

• 提取缓冲液没有加蛋白酶抑制剂；

• 样品反复冻融。

✅对策：

• 提取全程冰浴；研磨完立刻加预冷缓冲液；

• 提取缓冲临用前加 PMSF 1 mM（PMSF水溶液半衰期短，必须现加）；

• 离心后上清尽快测定，不要长时间存放。

2. 蛋白没有释放到上清，留在沉淀里面

• 研磨不充分，组织还是块状，蛋白锁在细胞碎片里；

• 木质化、纤维化严重的组织，只简单研磨，破碎不足。

✅对策：

• 液氮+石英砂，充分研磨成细腻粉末；液氮不要挥发完再加缓冲液；

• 浸提时间适当延长（冰上30‑40 min），期间颠倒混匀2‑3次；

• 不要高速离心过度，12000 g，15‑20 min即可。

3. 蛋白发生沉淀，不在上清

• pH偏离7.0‑7.4，蛋白变性析出；

• 多酚大量氧化，氧化多酚和蛋白结合，形成复合物被离心沉淀去掉。

✅对策：

• 复核缓冲液pH，稳定在7.2；

• PVP‑40（1%）+β‑巯基乙醇，络合多酚、抑制氧化；

• 避免研磨后样品接触空气太久。

4. 染料体系本身失效（对照排除）

用BSA标准品验证：加大BSA上样量，OD能正常上升 → 染料没问题，问题出在样品提取。

如果BSA加大上样OD也不涨：考马斯亮蓝染液变质、配比错误。

快速定位小试验

1. 拿正常BSA梯度测一遍标准曲线，确认染料、仪器没问题。

2. 取该样品沉淀，加入少量缓冲液重悬，煮沸5 min（强行释放蛋白），取上清测Bradford。

• 煮沸后OD明显升高：说明蛋白还在沉淀中，破碎/溶出的问题；

• 煮沸后OD依旧很低：蛋白已经被降解。

实操建议

这种情况不要靠加大上样量硬测，数据不可信，优先重新提取样品。

原创作者：广州奥斯莱生物科技有限公司