ICR 小鼠胚胎成纤维细胞（灭活）

背景描述：成纤维细胞是一类主要分泌细胞外基质的细胞，来源于胚胎时期中胚层的间充质细胞。小鼠胚胎成纤 维细胞通常用做胚胎干细胞培养的饲养层细胞。

ICR 小鼠胚胎成纤维细胞（灭活）（简称 MEF）来源于 13.5 天的 ICR 胎鼠的躯干和四肢，单 层细胞培养，培养至 P1 代经γ-射线灭活后冻存。MEF 用于培养小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞，维持其未分化状态。

培养条件：准备 ICR 小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基。

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

质量控制：1.通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测。

2.通过细胞复苏活力检测，复苏存活率>80%。

3.通过细胞 ES 支撑能力检测。

细胞检测：不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

供应限制：仅供科研使用

运输方式：常温或冻存（T25瓶或者1mL冻存管包装）

注意事项：处理原则

1. 严格的无菌环境。务必保证实验室整体、超净台和培养箱的清洁。

2. 规范的操作方式。请按照产品说明书描述的方式操作，严格控制变量，做好对照实验。

3. 需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。本产品需使用适合贴壁细胞生长的培养容器，且不建议重复使用。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。

4. 在接种胚胎干细胞的前一天复苏 MEF。

注意：本产品冻存液中含有 DMSO，其具有潜在风险，请谨慎处理。

产品特性

1. γ-射线灭活处理，不可增殖。

2.能维持小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞的未分化状态及细胞增殖能力。

培养瓶/皿包被 0.1%明胶

所需材料 ： 0.1%明胶溶液

操作步骤

注意：为了使γ射线照射处理的小鼠胚胎成纤维细胞更有效地贴附于培养器皿，要对培养器皿的表面进行明胶包被。

1. 加适量 0.1%明胶到培养瓶/皿中，能覆盖整个培养瓶/皿底面即可。

2. 摇匀液体使其覆盖整个培养瓶/皿的底面。

注意：明胶必须包被均匀，容器底面不可残留气泡。

3. 将铺有明胶的培养瓶/皿放在超净台静置至少 30 min。

4. 30 min后，弃去明胶，待培养瓶/皿晾干后，即可用于接种细胞。

注意：包被明胶的培养瓶/皿在无菌和明胶不蒸干的条件下，可以在 4°C 保存两周。

ICR 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的复苏

所需材料

1.ICR 小鼠胚胎成纤维细胞

2.小鼠胚胎成纤维细胞完全培养基

操作步骤

注意：收到的细胞如 24 h 内复苏，可存放于-80℃冰箱；超过 24 h 请存放于液氮中，复苏前 10 min 取出， 放于-80℃，让管中液氮挥发。

1. 水浴锅 37℃预热，完全培养基温浴到 37℃。

2. 在 15 mL 离心管中加入 5 mL 以上完全培养基备用。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞，放入 37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意:

1）融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；

2）晃动时应避免水没过管盖造成污染；

3）管内冻存液融化至只剩一个约 2 mm 直径的冰晶时，即停止水浴。继续晃动冻存管，至冰晶融化。

4. 用 75%医用酒精擦拭冻存管外表面。

5. 在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。

6. 用 1 mL 完全培养基洗涤冻存管 1 次，收集残留细胞，减少损失。

7. 细胞悬液以 250×g 离心 4 min。

注意：请以公式 a=ω2r（a:向心加速度；ω:旋转角速度，ω=πn/30；r:转子半径）计算相应转速。

8. 离心后去除上清。加入 2 mL 完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

9. 将细胞按 2.5×10 4个活细胞/cm2的密度接种到培养器皿中，加入足量的胚胎成纤维细胞完全培养基，轻轻摇晃细胞培养器皿使细胞均匀分布。

10. 摇匀细胞，放入 37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的二氧化碳培养箱中。

注意：接种 2 h 内不可移动、观察细胞。这会影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。

11. 复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基。

注意:

1）若发现较多漂浮细胞或其他异常情况，应及时排查原因，并与我们联系；

2）胚胎干细胞复苏前一天复苏 MEF 细胞；

3）如果 MEF 细胞换液当天将复苏小鼠胚胎干细胞，可以直接更换成小鼠胚胎干细胞培养基；4）复苏后的 MEF 应在 3 天内使用。