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PCR 的这些小知识，您都知道吗？

点击次数：1126发布时间：2022/10/23 12:41:18

开篇之先问个小问题

您知道 PCR 的中文全称是什么吗？

▼

这是小编参加研究生面试时导师问的第一个问题，当时简直不敢相信自己的耳朵。如果您和我一样有片刻的犹豫，请备好小板凳，我们一起回顾一下简单 PCR 中那些需要我们了解的小知识。

PCR 基础知识

PCR（Polymerase Chain Reaction），中文全称为聚合酶链式反应，是分子生物学研究中为广泛应用的技术。在 70 年代的时候次报道使用聚合酶及合成引物进行单链 DNA 的扩增，但直到 1983 年才正式作为一种研究工具用于 DNA 的扩增。自此以后，PCR 成为分子生物学研究不可缺少的一部分，被应用于从基础研究到疾病诊断、农业检测及法医调查等域。其发明者 Kally Mullis 因此获得了 1993 年的诺贝尔化学奖。

PCR 可在短时间内将单个 DNA 扩增得到成千上万个拷贝。其过程主要由 3 步组成：（1）变性，双链 DNA 经加热变成单链DNA；（2）退火，引物与模板的特异性结合；（3）延伸，DNA 聚合酶沿着模板，将引物的3’端延伸。

PCR 反应体系中的 6 大关键组分

PCR 的成功取决于很多因素，其反应组分在扩增中起着至关重要的作用。以下总结了在 PCR 反应体系设置中需要考虑的一些重要因素。

【模板 DNA】

DNA 扩增的模板可以是多种来源，如基因组 DNA（gDNA）、互补 DNA（cDNA）和质粒 DNA。DNA 的组成和复杂程度决定了 PCR 扩增的佳模板起始量。比如，在 50 μL 体系中 0.1-1 ng 质粒 DNA 已经完全足够，但同样体系需要 5-50 ng 的 gDNA。佳模板起始量同时也取决于所用的 DNA 聚合酶类型，经过基因工程改造过的 DNA 聚合酶增强了与模板的亲和度，其灵敏度更高，因而所需的模板量少。过低的模板量会减少 PCR 的产量，过高的模板量可能造成非特异性扩增，所以 DNA 模板量的优化尤为重要。

除了 gDNA、cDNA 和质粒 DNA，PCR 产物也可作为模板以获得更高的产量。但 PCR 产物中存在的残余反应组分（如引物、dNTP、盐和副产物）可能会影响下一次的 PCR 反应。所以推荐在下一次 PCR 使用 PCR 产物纯化试剂盒将 PCR 产物先进行纯化。

【DNA 聚合酶】

DNA 聚合酶是PCR扩增中关键的组分。Taq DNA 聚合酶是用于 PCR 扩增广为人知的聚合酶，它的发现变革了 PCR 的应用。Taq DNA 聚合酶有相对较高的热稳定性，在95 ℃有约 40 min 的半衰期。其合成速度约 60 s/kb，可扩增约 5 kb 的片段。所以 Taq 酶适用于一般的常规 PCR。如，新一代的DNA聚合酶经研发可获得更好的PCR性能，如 SuperFi DNA 聚合酶、Phusion 高保真 DNA 聚合酶等。

在 50 μL 体系中，一般 1-2 units 的DNA聚合酶已经足够用于 PCR 扩增。但当扩增复杂模板时，需要适当调整所使用聚合酶的量。比如当抑制剂存在时，DNA 聚合酶的增加会提高 PCR 产物的产量。但过多的 DNA 聚合酶会引起非特异性扩增。

【引物】

引物的设计应考虑以下因素：

【dNTP】

dNTP 包含 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP，作为合成新 DNA 链的原料。通常情况下 4 种 dNTP 是等量加入反应体系中。只有当进行随机突变等特殊应用时，加入不同浓度的 dNTP 有助于突变的产生。一般情况下，PCR 反应中每种 dNTP 的推荐浓度为 0.2 nM。当 Mg2+浓度过高时，因 Mg2+ 可与 dNTP 结合，适当加入多量的 dNTP 有助于 PCR 反应的进行。但过多的 dNTP 也会抑制 PCR 反应。当使用非校正 DNA 聚合酶时，降低 dNTP 的浓度（0.01-0.05 nM）及 Mg2+ 浓度有助于提高保真度。

【Mg2+】

Mg2+ 作为 DNA 聚合酶的辅助因子有助于 dNTP 的结合。在酶活性位点处的 Mg2+催化引物3’羟基和 dNTP 磷酸基团间磷酸二酯键的形成，另外 Mg2+ 可通过稳定磷酸基团上的负电荷以加速引物和 DNA 模板复合物的形成。

通常情况下 Mg2+以 MgCl2 形式提供，但对于一些诸如 Pfu DNA聚合酶，Mg2+是以 MgSO4 形式提供，硫酸根在一些情况下可增强扩增能力。通常 Mg2+ 浓度在1-4 mM 范围，低 Mg2+ 浓度可导致无PCR产物或产物减少，高 Mg2+ 浓度可导致非特异性 PCR 产物生成。

【缓冲液】

PCR 反应缓冲液可为 DNA 聚合酶提供合适的化学环境。缓冲液的 PH 通常在 8.0-9.5 之间，一般是通过 Tris-HCl 来调节。

对于 Taq DNA 聚合酶，缓冲液中一个常见组分是来自 KCl 的 K+，其可促进引物的吸附。有时（NH4）2 SO4 可替代 KCl，NH4+ 有去稳定作用，尤其对于错配碱基间的弱氢键，因此可增强反应特异性。

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