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- 细胞培养基的配制 细胞培养题
在细胞培养 过程中，除了培养基外，还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS):主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。简单的BSS是Ringer。D-Hank"s与Hank"s的一个主要区别是者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank"s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO2的培养条件，Hank"s平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养相，溶液将迅速变酸，使用时应注意。
配制溶液应使用双蒸水或去离子水 。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液:取材进行原代培养 时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养 时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA 溶液，有时也用胶原酶(collagenase)溶液。
1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液(如面的D-Hank"s)，因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的pH是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后可以再调只pH7.5，也可不调。
使用细胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的细胞清洗液(100ml细胞清洗液加0.5g胰酶)，过滤除菌，分装于4度保存。
2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。
3.胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS 。
三、pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1.NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。
2.HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆 化培养时要添加HEPES。
四、抗生素:常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌 污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。
五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L(29.22g/L)，配制时应加温30℃，溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。使用时，在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)
在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基 的基本成分;而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解;需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常：
(1)频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性;
(2)过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。
