如何做出一手漂亮的 WB 结果？_分析方法_技术文章

实验室常见靶基因表达水平检测方法主要集中于在基因转录调控、转录水平和转录后 mRNA 加工及修饰等过程，合成后靶蛋白质也存在修饰。成熟 mRNA 翻译指导蛋白质合成量分析有多种检测手段，其中经典和广泛为业界是蛋白质免疫印迹杂交实验（Western blotting）, 也是论文中常见的数据呈现形式。

蛋白质免疫印迹杂交实验原理是将已分离的总蛋白在 β 巯基乙醇等存在时，高温破坏其三维空间结构充分暴露出抗原结合位点，使针对靶蛋白的抗体能与其结合，再与带有显色标记物（酶）二抗结合，终根据显色底物显色深浅判断靶基因蛋白的表达量。

其检测过程（步骤）如下：

显然, 免疫印迹杂交试验步骤多，包含多个影响实验结果因素，如 SDS-PAGE 胶浓度、合适甲醇配比转膜缓冲液、一抗来源及其特异性等，而对结果影响较为显著的步骤是蛋白样品的提取与处理，SDS-PAGE 浓度对蛋白分离效果，转膜条件和一抗抗体选取和孵育条件等。

本文主要通过比较实验，探讨后三个步骤对结果的影响。

（一）SDS-PAGE 对蛋白分离

同 PCR 实验中琼脂糖浓度对不同长度 DNA 区分度不同，SDS-PAGE 胶中分离胶浓度合理选取对将目的蛋白清晰从分子量大小类似蛋白中清晰分离出来很重要，常见 SDS-PAGE 分离胶浓度为 8% 和 12.5% 两类，分子量大小不同靶蛋白应选择合适浓度分离胶。

* 选择脂质合成限速酶基因（ACC1，265kD）和甘油三酯酯酶（ATGL，55kD）用于探讨分离胶浓度分离效果，下文中除去探讨条件外其余条件皆一致。

1. 对分子量较大的蛋白质（>200kDa）

2．对分子量较小的蛋白质 (<100kDa)

（二）转膜条件

* 转膜时间、电压和转膜缓冲液甲醇比例等对结果影响较大，因此根据研究的靶蛋白特点选择合适转膜条件至关重要。

1. 转膜时间

2. 转膜过程环境温度

3. 转膜缓冲液使用次数

4．转膜缓冲液中甲醇比例（v/v）

（三）一抗使用

* 使用 IRS1（150kDa）、pPERK（125kDa）和内质网应激 XBP1（29/55kDa）抗体等检测小鼠肝组织探讨一抗在多种条件下对结果影响（IRS1，pPERK 和 XBP1 用于 WB 检测难以出现清晰条带，因此选择合适的一抗及孵育条件就很关键）。

1. 一抗稀释溶剂

2. 一抗稀释比例

3. 一抗孵育时间

（四）二抗使用

* 高浓度的二抗会导致大量非特异性结合，造成 WB 背景较深。

1. 二抗稀释比例（洗释液 0.1%TBST）

（五）一、二抗孵育后 TBST 洗涤时间

* 一抗和二抗孵育后 TBST 洗涤时间和次数会影响背景深度。

一张漂亮的 WB 结果受多个关键因素影响，以上对比实验给出显示核心的影响因素是一抗选择和合适的转膜条件。

对于一抗而言，选择具有一定文献引用数的品牌不仅更容易得到清晰可信的结果同时更能够得到同行。其二，针对特定分子量大小靶蛋白而选择适当转膜条件（转膜时间，转膜缓冲液和必要低温环境）能够将 SDS-PAGE 胶上蛋白样品尽可能转移到 PVDF 膜上，同时减少蛋白不必要降解，这对于终获得清晰、可信结果也是需要考虑因素。

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