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技术文章
流式实验中样本制备与保存全流程指南
点击次数：758 发布时间：2026/5/27 15:18:13
流式实验中样本制备与保存全流程指南
概述
流式细胞术实验的样本制备与保存是实验成功的关键环节，其核心原则为保证细胞活性（活细胞分析）、抗原表位完整、细胞悬液单分散无团块、避免非特异性结合，根据不同样本类型及检测指标，其保存和制备的方法会有显著差异，了解并合理保存、制备样本，也是流式实验中不可或缺的一环。
1. 样本制备
外周血/骨髓
●抗凝：使用EDTA或肝素钠抗凝管收集，避免使用肝素锂（可能影响后续某些荧光染料）。
●红细胞裂解：通常使用商品化裂解液（如SNR-007 红细胞裂解液(10x，不含固定剂)），室温避光裂解3-15分钟，离心去除红细胞。注意：裂解后需充分洗涤。
⚠注意：如需分析血小板或避免活化，需特殊抗凝和处理流程。
悬浮细胞系
●直接收集细胞，用预冷的流式染色缓冲液（如含1% BSA的PBS）洗涤。
贴壁细胞系
●使用不含EDTA的胰酶或细胞刮刀轻柔处理，避免损伤细胞表面抗原。
●用含血清的培养基中和胰酶，洗涤。
组织样本
●机械分散（研磨、剪碎）或酶消化（胶原酶、DNA酶等）制备单细胞悬液。
●过70μm细胞筛去除团块，获得单细胞悬液。
💡关键：处理过程保持低温，避免细胞死亡和抗原损伤。
石蜡包埋组织
⚠需先脱蜡、抗原修复等特殊处理，技术难度较高，非标准流程，有选择的话一般不建议做这种样本的流式检测。
2. 样本染色
标准染色流程
●1. 封闭：用含1-5% BSA或血清（与二抗同源）的PBS，冰上封闭10-15分钟，减少非特异性结合。
●2. 抗体染色：
◆直接法：加入荧光标记一抗，避光冰浴20-30分钟。
◆间接法：先加一抗，洗涤后再加荧光二抗。
●3. 洗涤：用预冷流式缓冲液洗涤1-2次，去除未结合抗体。
⚠4. 固定：如需延迟上机，可用1-4%多聚甲醛（PFA）固定，冰上或4℃避光15-20分钟，然后洗涤。注意：固定后某些荧光蛋白（如GFP）可能淬灭，且部分抗原表位可能被破坏。
●5. 重悬：用300-500μL流式缓冲液重悬细胞，过35μm细胞筛后上机。
特殊样本或检测目标染色
●胞内/核内抗原：需行表面染色、固定、破膜（用甲醇或商品化破膜剂）、胞内染色。
●细胞因子：通常需先使用蛋白转运抑制剂刺激细胞4-6小时。
●DNA含量分析：用乙醇或甲醇固定后，用PI、7-AAD或DAPI染色。
3. 样本保存
短期保存（数小时内上机）
●处理后的样本置于4℃避光保存，在6小时内上机。未染色或已染色的单细胞悬液可暂存于4℃。
中期保存（24-72小时）
●表面抗原：染色后（或染色前）用1-4% PFA固定，4℃避光可保存24-72小时。注意固定时间不宜过长（一般≤24小时为佳），以免影响荧光强度。
●胞内抗原：通常固定破膜后不宜长期保存，应尽快检测。
长期保存（数天至数月）
●冻存细胞：制备新鲜单细胞悬液，用含10% DMSO的胎牛血清缓慢冻存于程序性冻存盒，-80℃或液氮保存。需要检测时按复苏步骤快速解冻，用含DNA酶的培养基洗涤，恢复活性后染色，注意部分抗原可能因冻存受损。
●固定后冻存：某些研究显示，PFA固定后的细胞可冻存于-80℃，但可能影响散射光和某些荧光信号。
样本处理与保存关键点
，不管是何种样本处理和保存，最终都需要保证实验效果，因此需要了解样本处理和保存需要注意的关键点：
✔✔保持细胞活性：处理全程在冰上或4℃进行（除非需要活化刺激），使用预冷缓冲液。死细胞会增加非特异性染色，可用死活染料（如PI、7-AAD、Fixable Viability Dyes）排除。
✔✔ 防止聚集：染色和上机前过细胞筛，保证单细胞悬液质量。
✔✔对照设置：必须设置未染色对照、单阳对照、同型对照（用于评估非特异性结合）、FMO对照（用于设门）。
✔✔避光操作：从染色开始全程避光，防止荧光淬灭。
✔✔抗体优化：使用前滴定抗体，确定最佳浓度。
✔✔浓度调整：上机前调整细胞浓度至10^6-10^7 cells/mL，避免堵塞仪器或信号过弱。
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原创作者：武汉尚恩生物技术有限公司
