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技术文章
细胞攻略 | HT-29(人结肠癌细胞)培养教程
点击次数：1660 发布时间：2025/10/13 15:51:02
细胞基本信息
HT-29(人结肠癌细胞)特点
1. 复苏后恢复时间较长
该细胞复苏后恢复时间较长，大约需要一周的时间，期间可能会有大量漂浮细胞，换液时需要将漂浮细胞离心收集后接回培养瓶中；
2. 细胞成簇生长
该细胞成簇生长，细胞胞体黑点较多是正常现象。细胞很难生长到100%，当汇合达到80%时，即可传代。
3. 消化时间
该细胞传代时需要使用含EDTA的0.25%胰酶（货号SNT-002），在37℃消化到细胞触角收回、部分脱落时再终止消化（大约1-2分钟，仅供参考），细胞成簇生长，需要轻轻地将细胞吹散。
4. 贴壁较慢
细胞复苏或传代后，贴壁较慢，建议48h后再进行换液等处理。
HT-29细胞收货攻略
常温细胞
T25瓶收货后，拆开外包装，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培养箱静置2-4h。
2. 吸走大部分培养基并留10-12 ml，显微镜下拍照保存细胞状态照片，观察细胞密度，若细胞密度大于80%即可按比例传代（传代比例建议1：2），若细胞密度低于70%可以留10-12 ml继续培养至细胞密度80%以上再进行传代培养。
冻存细胞
1. 细胞收货后尽快开箱检查，若干冰充足可以取出细胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天内复苏）短期保存或液氮中长期保存，若干冰完全挥发建议立即复苏细胞并联系销售人员解决。
2. 冻存细胞建议尽快复苏一管培养检查，以免超出售后期，复苏步骤参考复苏攻略。
3. 复苏一管细胞出现异常及时联系销售人员，在专业技术支持的指导下进行下一步操作。
HT-29细胞传代攻略
1. 先尽量吸干净T25瓶原培养基，再加3-4ml 提前预热的PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS。
2. T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层，将培养瓶放入37℃培养箱消化。
3. 消化到细胞间隙变大，部分细胞完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化。
4. 混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清。
5. 加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里，补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养。
HT-29细胞冻存攻略
冻存步骤
1. 先将细胞按传代步骤消化、离心，至传代步骤4，弃细胞上清，获得细胞沉淀；
2. 加入适量预先配好的程序性冻存液轻轻重悬细胞，并将细胞悬液转移至做好标记的冻存管中；
3. 将冻存管放入程序性冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；
4. 转移细胞至液氮保存并登记细胞保存位置，液氮保存24h后建议复苏一管检测冻存细胞的活性，若活性合格即可长期保存，若低于80%建议重新冻存；
HT-29细胞复苏攻略
复苏步骤
1. 将所需的完全培养基放在培养箱预热30min后开始复苏；
2. 准备37℃温水，将细胞从液氮罐取中出，观察管内无液氮的情况下，捏住管盖，将细胞冻存部分浸入温水轻轻摇晃，融化至米粒大小冰块，终止水浴；
3. 将冻存管以离心力150g(约900rpm)左右离心1-2min，不同离心机具体转速会有差异；
4. 离心完成后，弃冻存液，用刚才预热的培养基缓慢加入冻存管，并轻柔重悬细胞后接种至T25或者10cm皿中。
常见问题及解决方案
细胞密度怎么计算的？
严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；
NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？
1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。
2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
NO.3细胞具体消化时间是多久？
每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完全规定消化时间，以实际消化效果和客户经验为准。
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原创作者：武汉尚恩生物技术有限公司
