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细胞复苏失败原因分析——复苏篇
点击次数：2672 发布时间：2025/2/6 10:33:04
细胞复苏成败和冻存及复苏操作密切相关。上个星期和大家分享了细胞冻存方面容易出错的细节，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇主要从复苏角度分析，排查复苏过程中容易出现的问题。
同样，我们先复习一下复苏步骤：
1. 提将水浴锅预热至37℃，培养基复温，离心机设置好转速；
2. 准备一个15ml离心管并加入适量培养基。
3. 取出冻存管，浸入水浴锅迅速摇晃使细胞在2min内充分融化；
4. 将细胞悬液缓慢滴入提加了培养基的离心管，1000rpm 3min离心；
5. 弃上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，放入培养箱。
1. 若液氮或冰箱距离水浴锅较远，没有做保冷措施
为防止细胞在运输路上开始融化（特别是夏季），冻存细胞需要放在干冰或冰盒上运送至水浴锅。
2. 运输冻存管时手触碰到细胞部分或放在了口袋里
请勿用手触碰冻存管身，避免局部温度升高导致细胞开始融化。应捏住管盖或放在容器中运输
3. 采用错误的方式融化细胞
不要用手捂化（搓热也不行），手心温度不够高，细胞受热不均匀且降温速度太慢导致细胞死亡。
4. 水浴时没有严格控制时间，直接放水里静置，没有晃动促进融化
细胞复苏需遵循“快融”原则，建议在2min内将细胞充分融化，水浴时间越长活率越低。z好的方法是捏住管盖，将管身浸没水中快速摇晃，促进细胞融化。切忌将冻存管静置在水浴中。
5. 水浴结束时管内还有较大冰块
如果没融化完quan，还有比较大的冰块，也会导致细胞死亡。一方面冰块中的细胞缓慢升温而死亡，另一方面冰块导致已融化的细胞被低温损伤。
有的同学说2min的水浴很难让细胞融化，那么咱们可以将水浴锅温度提高至39度（小编亲测可行），摇晃速度加快，担心污染可以将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴。水浴锅里的水不能太少，否则冻存管放入水后局部温度会达不到预设温度，导致融化过慢。
6. 细胞融化后没有离心去除DMSO
有的同学复苏细胞会在细胞融化后加10倍培养基稀释，不离心直接培养，等细胞贴壁后换液。虽然这对于好养的贴壁细胞是可行的，但不是长远之计，也不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞有一定毒性，有些细胞对DMSO比较敏感，如HL-60细胞等。如果你不清楚自己的细胞是否对DMSO敏感，那么还是离心去除上清为保险。
以上由小尚多年经验总结而来，结合冻存篇，基本可以解决所有复苏失败的问题。如果还有没提及的知识点，欢迎同学们可以在评论区补充~
原创作者：武汉尚恩生物技术有限公司
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