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新城疫病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
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详细内容

新城疫病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品特点
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV),也叫禽副粘病毒1型,属于副黏病毒科禽副黏病毒属。新城疫病毒是ssRNA病毒,有包膜,病毒颗粒具多形性,有圆形、椭圆形和长杆状等,成熟的病毒粒子直径100~400nm。新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强,55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周,在-20℃中存放几个月或在⁻⁷0℃中存放几年,其感染力均不受影响。新城疫是由新城疫病毒中强毒株引起禽的一种高度接触性染病,以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征,具有很高的发病率和病死率,是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告疫病,我国将其列为一类进境动物疫病。因此对新城疫病毒的快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测新城疫病毒的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化,分析灵敏性高,可以达到100拷贝/µL。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据新城疫病毒RNA高度保守区设计,不会跟其他的RNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20µL体系的探针法qRT-PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
成分 | 规格 | 包装 |
探针法qRT-PCR缓冲液 | 0.5mL | 0.5mL蓝盖管 |
探针法qRT-PCR酶混合液v2 | 50µL | 0.5mL红盖管 |
荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | 1.5mL绿盖管 |
超纯水 | 1mL | 1.5mL蓝盖管 |
新城疫病毒qRT-PCR引物-探针干粉 | 50次 | 1.5mL棕色管 |
新城疫病毒qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/µL) | 50µL | 0.5mL黄盖管 |
使用手册 | 1份 | 无 |
本产品采用五孔盒包装 | ||
注意:引物-探针干粉在使用前需要短暂离心,然后在离心管中加入162µL的超纯水充分混匀后再使用,未用完的需要-20℃保存。 | ||
一、稀释标准曲线样品(以10E1-10E6拷贝/µL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。
2. 用带芯枪头分别加入45µL荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)。
3. 在6号管中加入5µL1×10E7拷贝/µL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/µL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在5号管中加入5µL1×10E6拷贝/µL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/µL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在4号管中加入5µL1×10E5拷贝/µL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E4拷贝/µL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
7. 如果有N个样品,设置N+2个提取,多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照),一个是样品制备NC(样品制备阴性对照)。可以用10µL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置qRT-PCR反应(20µL体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),5个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):
成分 | 样品管 | RT-PCR | 标准曲线样品管 |
探针法qRT-PCR缓冲液 | 各10µL | 10µL | 各10µL |
探针法qRT-PCR酶混合液v2 | 各2µL | 2µL | 各2µL |
新城疫病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液 | 各3µL | 3µL | 各3µL |
N+2个待测RNA样本 | 各5µL | 不加 | 不加 |
超纯水 | 不加 | 5µL | 不加 |
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号) | 不加 | 不加 | 各5µL |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行RT-PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 15min |
预变性 | 95℃ | 5min |
PCR反应 (40个循环) | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec(采集FAM通道的荧光信号,淬灭基团为BHQ1) |
新城疫病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
四、数据处理
12. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性,则整个扩增或制备实验无效,不需要分析数据,需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性,说明环境污染,则整个扩增或制备实验无效,不需要分析数据,需要跟厂家联系,购买新的引物和探针。
13. 如果阴性对照和阳性对照正常,则实验有效,可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于35,否则实验无效。如果实验有效,则分析待测样品,如果无Ct或Ct大于或等于35,则为阴性。如果Ct小于35则为阳性。
自备试剂
样品RNA,超纯水
运输及保存
低温运输,-20℃保存,保存期限为1年
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